泄濁解毒方對慢性非特異性潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜環氧合酶-2及前列腺素E2的影響※

劉建平　李玲玲　郎曉猛　任　杰　趙　源　楊　倩

(河北省中醫院脾胃病一科，河北　石家莊　050011)

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泄濁解毒方對慢性非特異性潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜環氧合酶-2及前列腺素E2的影響※

劉建平李玲玲1郎曉猛任杰趙源2楊倩△

(河北省中醫院脾胃病一科，河北石家莊050011)

【摘要】目的觀察泄濁解毒方對慢性非特異性潰瘍性結腸炎(CUC)大鼠結腸黏膜中環氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)表達的影響，探究其可能的作用機制。方法將40只雄性Wistar大鼠適應性飼養1周后，隨機分為5組，即空白組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄濁解毒方高劑量組、泄濁解毒方低劑量組，每組各8只。除空白組外，其余4組大鼠以三硝基苯磺酸(TNBS)聯合乙醇造模法復制CUC動物模型。造模成功后第5 d，空白組及模型組大鼠予0.9%氯化鈉注射液5 mL灌胃，柳氮磺胺吡啶組予柳氮磺胺吡啶混懸液0.3 g/kg 灌胃，泄濁解毒方高、低劑量組分別予20.0、10.0 g/kg泄濁解毒方藥液灌胃，均每日1次，連續給藥14 d。用藥結束后以免疫組化法測定大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2的表達。結果模型組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平均較空白組明顯提高(P<0.05)；與模型組比較，泄濁解毒方高劑量組、低劑量組及柳氮磺胺吡啶組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平明顯下降(P<0.05)，且泄濁解毒方高劑量組低于柳氮磺胺吡啶組(P<0.05)。結論泄濁解毒方治療CUC大鼠效果良好,抑制COX-2表達、減少PGE2生成可能是其作用機制。

【關鍵詞】結腸炎，潰瘍性；大鼠；解毒劑(中藥)；動物實驗；前列腺素E類

※項目來源：2014年度河北省自然科學基金資助項目(編號：H2014206462)

慢性非特異性潰瘍性結腸炎(chronic nonspe-cific ulcerative colitis，CUC)是一種以結腸黏膜慢性炎癥及潰瘍形成為病理特點的慢性非特異性炎癥，其病變主要累及直腸、結腸黏膜，為消化道常見病和疑難病。本病在西方國家患病率為100~200人/10萬[1]，近年來我國發病率呈逐年上升趨勢，探討其發病機制及治療手段意義重大。目前西醫對CUC的病因及發病機制研究尚不十分明確，認為免疫異常、遺傳易感、感染、精神、飲食及環境等均與其發生發展有關，其中免疫因素是當今研究的熱點。環氧合酶-2(COX-2)催化花生四烯酸(AA)合成炎性介質前列腺素E2(PGE2)，造成炎細胞浸潤，進而發生結腸黏膜炎癥、組織破壞及潰瘍形成。本實驗通過觀察對比泄濁解毒方、柳氮磺胺吡啶對CUC大鼠的治療作用及其結腸黏膜中COX-2及PGE2表達的差異，探討泄濁解毒方對CUC的可能作用機制，結果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性Wistar大鼠40只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，一級，健康清潔級，體質量220~250 g，動物合格證號1210003。

1.1.2實驗藥物及試劑泄濁解毒方，藥物組成：大血藤、敗醬草、黃連、魚腥草、車前子、黃芩、半夏、葛根、薏苡仁、木香。采用醇提取和水提取相結合濃縮至所需濃度，冰箱4 ℃貯存備用。泄濁解毒方低劑量、高劑量分別相當于成人用量(1.45 g/kg)的7倍、14倍，按照10.0、20.0 g/kg給藥。柳氮磺胺吡啶片(上海中西醫三維制藥有限公司，國藥準字H31020450，批號20120518，規格250 mg/片)，片劑研末過100目篩細粉，與蒸餾水溶成混懸液，按照0.3 g/kg給藥。三硝基苯磺酸(TNBS)，美國 Sigma 公司生產；COX-2 一抗，由圣克魯斯生物技術(上海)公司提供；PGE2一抗，Beijing Biosynthesis Biotechnology CO，Ltd生產；VECTASTAIN@ABC免疫組化試劑盒，Vector Laboratories 公司生產；50%乙醇、乙醚等試劑由河北省中醫院提供。

1.1.3主要實驗儀器DP73 數碼顯微鏡，日本Olympus公司；HM-200電子天平，日本Olympus公司；BM-Ⅱ型病理組織包埋機，安徽電子科學研究所；DL-CJ-1N 高性能無菌實驗臺，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；DW-40L262 立式低溫冷藏箱，青島海爾醫用低溫科技有限公司；HMIAS-2000顯微圖像分析系統，武漢同濟醫科大學；HMIAS-2000W彩色圖文分析系統，武漢千屏影像技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1模型制備40只實驗大鼠適應性飼養1周后，隨機分為5組，即空白組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄濁解毒方高劑量組、泄濁解毒方低劑量組，每組各8只。除空白組外，其余4組只大鼠參照文獻[2-3]方法以TNBS 聯合乙醇造模法復制CUC動物模型。

1.2.2給藥方法造模成功后第5 d，空白組及模型組大鼠予0.9%氯化鈉注射液5 mL灌胃，柳氮磺胺吡啶組予柳氮磺胺吡啶混懸液0.3 g/kg 灌胃，泄濁解毒方高、低劑量組分別予10.0、20.0 g/kg泄濁解毒方藥液灌胃，均每日1次，連續給藥14 d。

1.3觀察指標及方法

1.3.1標本采集末次給藥后，5組大鼠禁食不禁水24 h，25%烏拉坦0.8 g/kg腹腔注射麻醉，沿腹部正中線切開后，留取結腸標本，縱行切開，用冰0.9%氯化鈉注射液沖洗后，選病變最明顯部位置于4%多聚甲醛中固定，并分別編號，石蠟包埋。

1.3.2觀察指標以免疫組化法測定大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2的表達，操作嚴格按試劑盒說明書步驟進行。

2結果

5組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平比較見表1。

表1　5組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平比較

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，#P<0.05

由表1可見，模型組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平均較空白組明顯提高(P<0.05)；與模型組比較，泄濁解毒方高劑量組、低劑量組及柳氮磺胺吡啶組大鼠結腸黏膜COX-2及PGE2表達水平明顯下降(P<0.05)，且泄濁解毒方高劑量組低于柳氮磺胺吡啶組(P<0.05)，與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

中醫學并無CUC病名，根據其主要癥狀及臨床特點，常將其歸于腹痛、痢疾、腸風、腸癖、泄瀉等病范疇。CUC病位在腸，病因多樣，病機復雜。我們認為濕濁久羈、蘊熱而致濁毒內生為CUC的病機關鍵：濁毒蘊結腸道，內聚不散，腸道傳導失司；脂膜血絡受損，血溢脈外，肉腐成膿，進而出現黏液、膿血便等典型癥狀，形成CUC。我們采用具泄濁升清、解毒祛瘀功效的泄濁解毒方治療。藥用大血藤、敗醬草清熱敗毒，散瘀排膿，為君藥；黃連、魚腥草、車前子、黃芩、半夏燥濕解毒，共為臣藥；葛根升陽止瀉，薏苡仁健脾化濕，清熱排膿，木香理氣止痛，共為佐使。諸藥并用，升清泄濁，散瘀解毒。

目前西醫認為，CUC是由多種因素共同造成，包括免疫、遺傳、感染、環境、精神和飲食等，其中免疫因素被多數學者認為在CUC發生、發展過程中起重要作用。作為多種免疫因子合成前體，AA一旦代謝紊亂就會出現微循環受干擾、炎癥遞質被激活、氧自由基損傷、血管通透性增加、溶解纖維蛋白活性增加以及凝血障礙等，造成機體損傷而發病[4-5]。COX是體內催化AA合成各種內源性前列腺素的關鍵酶，參與了上述的大多數反應。COX-2是COX的一種同工酶，在CUC的發生及其誘發癌變的病理過程中起關鍵作用[6-8]，其在正常腸黏膜一般不表達或低表達，當受到炎癥介質、內毒素、細胞因子、生長因子等刺激時，表達迅速上調，催化AA合成多種過量的前列腺素(PG)類物質。PGE2為其中的主要產物，是一種重要的炎癥因子，可使血管通透性增加，造成組織水腫；趨化白細胞，導致炎細胞浸潤，引起結腸黏膜炎癥、組織損傷，從而形成潰瘍[9]；還可誘導細胞增殖，促進細胞黏附，抑制具有免疫調節功能的淋巴因子的產生，抑制T細胞和B細胞增殖[10]，造成免疫損傷。現代藥理研究表明，泄濁解毒方中魚腥草含魚腥草素、揮發油、蕺菜堿、槲皮苷、氯化鉀等，具有提高機體免疫力、抗炎、抗病毒及抗腫瘤作用[11]。車前子具有抗病原微生物作用[12]，體外抑菌實驗發現，對同心性毛癬菌、星形奴卡菌等有不同程度的抑制作用，且金黃色葡萄球菌對其高度敏感，醇提取物可殺滅鉤端螺旋體；車前子多糖能恢復、提高及改善機體免疫功能[13]。敗醬草對多種感染性疾病有療效，可用于治療消化道炎癥；敗醬草總環烯醚萜苷元可顯著提高小鼠胸腺指數和脾指數，增強免疫功能，其提取物還具有止血作用[14]。黃連對人結腸癌細胞中COX-2轉錄活性有抑制作用，抗菌作用強，亦可通過抗炎作用發揮抗腹瀉作用[15]。黃芩主要含黃芩甙、黃芩素，抗菌譜較廣，對多種細菌、皮膚真菌、鉤端螺旋體等都有抑制作用；黃芩黃酮具抗癌作用；黃芩提取物黃芩甙元可抑制COX-2活性和蛋白表達[16-17]；黃芩還具有退熱、調節機體免疫平衡及腸道微生態平衡失調的作用[18]，從而更好地加強止血作用。大血藤可抗菌、 抗氧化、抗腫瘤，水提取物能顯著抑制小鼠腸蠕動速度[19]。半夏含揮發油、多糖、半夏蛋白，具抗癌、凝血作用，半夏蛋白也是一種植物凝集素，對紅細胞有凝集作用[20]。薏苡仁含有多種活性成分，有抗腫瘤、增強機體免疫功能及鎮痛消炎作用[21]。木香具有免疫調節、抗潰瘍、抗炎、解痙、鎮痛及抑制小鼠腸蠕動的作用[22]。

實驗結果顯示，與空白組相比，COX-2及PGE2在CUC大鼠結腸黏膜中的表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。經泄濁解毒方治療后，COX-2及PGE2表達水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，以泄濁解毒方高劑量組差異最明顯，提示其治療CUC的作用機制可能是：通過降低COX-2的表達，減弱對AA的催化作用，減少其下游炎癥介質PGE2的生成，從而控制CUC炎癥反應過程。

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(本文編輯：曹志娟)

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醫療氣功令國際友人著迷

在地處北戴河的河北省醫療氣功醫院，每到夏季幾乎天天都可以看到國際友人在該院氣功師的引領下，認真地學習醫療氣功。近年來，醫療氣功越來越受到國際友人的歡迎。河北省醫療氣功醫院作為醫療氣功的教學和傳播基地，每年都吸引許多國際友人前來學藝。

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1河北省直屬機關第二門診部中西醫結合科，河北石家莊050051

2河北醫科大學研究生學院，河北石家莊050071

Study of Xiezhuo-jiedu formula on Cycloxygenase-2 and prostaglandin E2of intestinal mucosa in chronic nonspecific ulcerative colitis ratsLIUJianping*,LILingling,LANGXiaomeng,etal.*FirstDepartmentofSpleenandStomachDisease,HospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,Hebei,Shijiazhuang050011

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and possible mechanism of Xiezhuo-jiedu formula on the expression of cycloxygenase-2 (COX-2) and prostaglandin E2(PGE2) in colon tissues of chronic nonspecific ulcerative colitis rats. MethodsAfter 40 experimental rats were allowed to acclimate for 1 week,these rats were randomly divided into blank group, model group, salazosulfapyridine group, Xiezhuo-jiedu high-dose group and Xiezhuo-jiedu low-dose group, 8 rats in each group. Expect blank group, rats in other four groups were constructed in chronic nonspecific ulcerative colitis model through trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) combined ethanol mode method. Five days after modeling, rats in blank and model group were received 0.9% sodium chloride injection (5 mL) by gavage, rats in salazosulfapyridine group were received salazosulfapyridine suspension (0.3 g/kg) by gavage. Rats in Xiezhuo-jiedu high-dose and low-dose group were received Xiezhuo-jiedu formula at a dose of 20.0 g/kg and 10.0 g/kg respectively. All rats were administered once a day continuously for 14 d. The expression of COX-2 and PGE2in colon tissues was detected by immunohistochemical method after administration. Results The expression of COX-2 and PGE2of colon tissnes in model group was obviously higher than that in blank group (P<0.05). As compared with model group, the expression of COX-2 and PGE2in Xiezhuo-jiedu high-dose, Xiezhuo-jiedu low-dose and salazosulfapyridine group were obviously decreased (P<0.05), and the decrease in Xiezhuo-jiedu high-dose group was obviously lower than that in salazosulfapyridine group (P<0.05). Conclusion Xiezhuo-jiedu formula has satisfactory treatment effect in chronic nonspecific ulcerative colitis rats. Its mechanism may be involved to suppress the expression of COX-2 and reduce PGE2generation.

【Key words】Colitis; Ulcerative; Rat; Antidote; Traditional Chinese medicine; Animal experiment; PGE2

(收稿日期：2014-12-31)

作者簡介：劉建平(1963—)，女，主任中醫師，教授，博士，碩士研究生導師。研究方向：中醫內科脾胃病學。

通訊作者：△河北省中醫院脾胃病二科，河北石家莊050011

【中圖分類號】R574.621；R285.5；R286.93

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)12-1832-04

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.022