電針對腦缺血再灌注的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調控作用研究思路※

趙建新　田元祥　冉清智

(北京中醫藥大學第三附屬醫院針灸科，北京　100029)

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學 術 探 討

電針對腦缺血再灌注的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調控作用研究思路※

趙建新田元祥△冉清智1

(北京中醫藥大學第三附屬醫院針灸科，北京100029)

【摘要】目的探討電針對腦缺血再灌注(I/R)的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調控作用研究思路。方法參考相關文獻，結合前期研究發現，以研究假說的方式對電針對腦I/R的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調控作用進行論證闡述。 結果腦I/R損傷可誘發神經細胞凋亡，在這個信號轉導過程涉及多個基因的表達及相互作用，JNK信號通路介導的細胞凋亡在腦I/R損傷中起重要作用，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素8(IL-8)是腦I/R形成的標志物，電針治療可抑制神經細胞凋亡，減輕腦I/R損傷，保護神經元，應用Bax基因敲除小鼠使研究得以深化。結論研究以Bax基因敲除小鼠為基礎，從JNK信號轉導線粒體通路的不同環節—I/R模型、I/R特征、JNK活化、Bcl-2與Bax平衡、凋亡誘導因子(AIF)釋放、細胞凋亡結果的多個層次，可以闡明電針調控腦I/R損傷海馬神經元細胞凋亡的JNK信號轉導caspase非依賴的線粒體通路機制。

【關鍵詞】腦缺血；再灌注損傷；疾病模型，動物；小鼠；針刺療法；線粒體；細胞凋亡；白細胞介素類

我們在前期研究中發現，電針百會、腎俞、膈俞穴組穴的益腎醒腦針法可以通過上調海馬熱休克蛋白70(HSP70)、c-fos、Bcl-2的表達，下調Bax表達，降低凋亡率，抑制海馬細胞凋亡，保護神經元[1-7]。Bax基因是腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷過程中JNK/MAPK信號通路中的線粒體途徑的主要介導者，在誘導神經細胞凋亡過程中起著重要作用，但也只是其中的一個鏈條。電針是如何由刺激通過JNK/MAPK信號通路中的線粒體途徑的細胞信號轉導發揮上述作用尚不清楚。因此，本研究擬探討電針對腦I/R的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調控作用研究思路。

1腦I/R損傷可以誘發神經細胞凋亡

腦I/R損傷是腦I/R期繼發性損傷，是腦血管疾病、腦腫瘤等引發的腦缺血及腦組織損傷的主要病理機制，可以誘導神經細胞凋亡[8-11]，導致海馬損傷[12-20]和皮層損傷[13，21-25]。

短暫性缺血后，缺血中心區域的神經細胞很快出現細胞壞死。但在缺血中心區域周邊的神經細胞，一般經過1～2 d，才出現延遲性神經細胞退化。已證明這種延遲性細胞退化就是細胞凋亡[26]。對大鼠腦I/R后大腦皮質和紋狀體神經細胞凋亡的變化進行動態觀察發現，腦I/R 1 h，紋狀體水腫區可見少量凋亡細胞，隨著再灌注時間的延長，凋亡細胞逐漸增多，散見于紋狀體、大腦皮質，再灌注24～48 h凋亡細胞數量達到高峰；再灌注24 h時，可見凋亡細胞的各種形態[26-27]。也有研究發現，細胞凋亡的神經元數目在急性腦I/R 24 h明顯增加，在48、72 h進一步增加，存活神經元數目隨著再灌注時間的延長逐漸下降[8]。顯示在腦I/R 損傷時神經細胞凋亡起著重要作用。

腦I/R過程中模型大鼠形成大腦皮層損傷[21]，大鼠海馬區凋亡細胞也可見增多[18，27-28]，腦I/R 7 d 模型小鼠大腦皮質變薄，部分神經細胞核固縮，局限性神經元數目減少，出現篩網狀結構，膠質細胞增生，15、30 d 鏡下與7 d 基本相同。海馬CA1 區細胞脫失，隨時間推移逐漸加重，至術后30 d，海馬CA1 區細胞幾乎完全脫失，膠質細胞大量增生，形成結節，CA2、CA3 區細胞也嚴重脫失，呈現海馬錐體細胞的遲發性壞死[12,29]。腦I/R 損傷大鼠海馬區c-fos蛋白、caspase-3和Bax的陽性細胞表達增強，凋亡細胞表達增多[9,28]。說明腦I/R 確實可誘發神經細胞凋亡。但是，電針是如何由刺激通過細胞信號轉導發揮作用尚不夠明確。

2腦I/R損傷誘發的神經細胞凋亡的信號轉導過程涉及多個基因的表達及相互作用

研究表明，細胞凋亡在腦缺血中發揮著重要作用。無論是急性的局灶性腦缺血，還是短暫性腦缺血后的遲發性神經元死亡，都有細胞凋亡的參與，在不同刺激信號的影響下，涉及多個基因表達及相互作用的復雜過程[30]。

細胞凋亡信號轉導的激活在體內細胞中因各種應激、刺激強度、作用方式和持續時間不同而結果有差異，細胞凋亡的多種信號途徑間也存在互通的交叉部分。在腦缺血中除了經典的死亡受體途徑(Fas/FasL 介導的是促凋亡信號通路)和線粒體途徑外，PI3K/Akt 通路和MAPK 通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，調節著細胞凋亡、生長以及一些重要基因的表達[38]。腦I/R模型小鼠海馬一氧化氮(NO)產生增多[20]，顯著增加硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)水平[16]，提高生產活性氧(ROS)，是一個重要的神經損傷[15]。腦I/R導致環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達的增加，以及激活p38和p42/44絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，導致氧化應激和炎癥反應損傷[14]。LR4介導的MyD88的依賴I/R 激活的信號通路可能通過上調NF-κB和腫瘤壞死因子α(TNF-α)參與I/R 損傷[23]。在右側皮質I/R 損傷中細胞內骨橋蛋白(iOPN)的增加，表明再灌注損傷的反應為iOPN的作用[25]。全腦I/R能夠促進谷氨酸受體6(GluR6)介導的c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路的激活，GluR6的S-亞硝基化促進GluR6-PSD95-MLK3信號模塊的組裝，從而激活MLK3及其下游的信號通路，呈現缺血性腦損傷[17]。

3JNK信號通路介導的細胞凋亡在I/R損傷中起重要作用

JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也被稱為應激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinase，SAPK)，是哺乳動物體內絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)超家族的一員[31]。JNK信號通路能夠被多種細胞外刺激因素激活誘導細胞凋亡，包括生長因子、細胞因子[TNF-α、白細胞介素1(IL-1)等]、應激(如紫外線照射、高滲透壓、I/R)等[32]，參與了許多細胞凋亡的發生[33]，其功能的失調被認為與多種疾病和病理損傷的發生發展密切相關，如神經退行性疾病、腫瘤、1型糖尿病、I/R損傷等[34-37]。因此，JNK信號通路可作為臨床上相關疾病的一個分子治療靶。但是，電針對I/R損傷作用的JNK信號通路的分子機制尚不清楚。JNK的大體概念圖見圖1。

圖1　JNK的大體概念圖

靜止細胞的JNK主要定位于細胞質，當被刺激因素激活后，部分活化的JNK就轉位到細胞核，通過磷酸化而激活多種核內轉錄因子，如活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)[38]、ATF2、P53、Elk-1和c-Myc2等[39-42]，促進相關靶基因的轉錄和新蛋白質的合成，發揮相應的生物學效應，這是JNK轉錄依賴方式的生物學基礎。近年來研究發現胞質中的某些成分也可能是JNK的作用底物，如Bcl-2家族(Bcl-2、Bcl-xL、Bim、BAD)等[43-45]。這表明JNK信號通路不僅可以調節核內靶基因的轉錄，還能夠通過直接調節胞質底物的結構和功能而快速地發揮相應的生物學效應，這是JNK非轉錄依賴方式的生物學基礎。JNK的定位、轉位、激活與功能發揮見如圖2。

圖2　JNK的定位、轉位、激活與功能發揮

JNK介導細胞凋亡的信號途徑目前認為其機制主要有2個。一是通過轉錄依賴的方式調節下游凋亡相關靶基因的轉錄和凋亡蛋白的表達而介導死亡受體途徑及線粒體途徑的細胞凋亡；二是通過非轉錄依賴的方式直接調節胞質內靶蛋白的活性(如Bim、Bcl-2等)而介導線粒體途徑的細胞凋亡[46]。但JNK介導的電針調控轉錄依賴方式抑或非轉錄依賴方式線粒體途徑的細胞凋亡的機制尚不清楚。JNK介導細胞凋亡的2條信號途徑見圖3。

圖3　JNK介導細胞凋亡的2條信號途徑

非轉錄因子途徑—線粒體途徑，是基于一部分活化的JNK留在細胞質內通過磷酸化作用直接調節Bcl-2家族成員(Bim、Bax、Bcl-2等)的活性而介導線粒體途徑的細胞凋亡[46-49]，此過程不依賴新基因的表達。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調控者，分為3類：促凋亡蛋白，如Bak和Bax；抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL，以及Bim、Bid等BH3-only蛋白[46,50]，其中Bax是線粒體途徑的主要介導者[51]?；罨腏NK能夠磷酸化激活Bax[46]，也可以通過磷酸化激活Bim等BH3-only蛋白和接頭蛋白14-3-3、抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白而激活Bax[46,48]。活化的Bax轉位至線粒體外膜，使線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C、Smac/DIABLO和凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)等促凋亡線粒體蛋白[50]。釋放到細胞質中的細胞色素C通過形成凋亡小體而啟動caspase依賴的線粒體途徑的細胞凋亡；Smac/DIABLO通過阻斷凋亡抑制蛋白IAPs的活性而啟動caspase依賴的線粒體途徑的細胞凋亡；AIF可以進入細胞核直接剪切DNA而誘導caspase非依賴的線粒體途徑的細胞凋亡[52]。JNK非轉錄因子途徑—線粒體途徑見圖4。

圖4　JNK非轉錄因子途徑—線粒體途徑

這與我們的前期研究發現密切相關。我們用流式細胞術(FCM)觀察電針對腦I/R 損傷小鼠海馬神經元凋亡及相關基因Bcl-2、Bax表達的影響，發現電針可上調小鼠海馬細胞Bcl-2表達，下調Bax表達，降低凋亡率，且療效優于甲磺酸雙氫麥角毒堿片，電針可起到抑制凋亡、保護神經元的作用[1]。但是，電針是通過調控細胞色素C的釋放，Smac/DIABLO的釋放，還是AIF的釋放，尚不清楚。

在I/R損傷過程中，活性氧等激活的JNK能分別通過死亡受體途徑和線粒體途徑介導細胞凋亡。對大鼠大腦局部I/R模型的研究發現，缺血區JNK活性明顯增加，JNK抑制劑sp600125可以阻斷Bax從胞質轉入線粒體，抑制了腦缺血誘導的神經元凋亡，病理改變減輕[53]。但電針是否和JNK抑制劑sp600125一樣可以阻斷Bax從胞質轉入線粒體，以及抑制的程度，尚不清楚。

4炎性因子TNF-α、IL-8是腦I/R形成的標志物

炎癥反應在腦I/R 損傷機制中擔負著重要角色，大量實驗已經證實，腦缺血后強烈的炎癥反應是造成腦組織繼發性損傷的因素之一，在此炎癥反應過程中，多種因素相互作用，共同引起再灌注損傷[54]。其中TNF-α、IL-8是腦I/R 形成的標志物。

TNF是Canswell EA等在1975年發現的一種能使腫瘤發生出血壞死的物質，它可分為TNF-α和TNF-β 2種，其中TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞分泌，也可由抗原刺激的T細胞、活化的NK細胞和肥大細胞分泌，屬多肽類激素，是具有廣泛生物學功能的多效細胞因子，主要與炎癥及免疫反應有關，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因[55]。有研究表明，星形膠質細胞參與了神經元保護及神經功能修復等，其機制可能與TNF-α的釋放有關，它的釋放可能參與了血腦屏障保護機制[56]。

IL-8是機體主要的炎癥趨化因子，對中性粒細胞有明顯的趨化和功能活化作用，同時參與了中性粒細胞和內皮細胞黏附過程的調節，在炎癥過程中起重要作用[57]。有研究發現，IL-8的變化與腦I/R 損傷存在一定的關系，IL-8在腦I/R 早期明顯升高[58-59]。Yamasaki Y等[60]發現再灌注后12 h始見中性粒細胞黏附于內皮細胞，并浸潤至腦實質，提示缺血區IL-8的濃度升高早于中性粒細胞的浸潤。

5電針治療可抑制神經細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷，保護神經元

針刺可以抑制腦I/R 損傷[61-68]，電針可以抑制腦I/R 損傷[33]，抑制大鼠脊髓神經元凋亡[69]和皮層海馬神經元細胞凋亡[1]。

腦I/R 損傷所致海馬神經元凋亡，主要是引發記憶障礙。針刺單穴及復方治療記憶障礙在古代文獻已有記載，如“遺忘”、“健忘”、“善忘”、“呆病”、“文癡”等。近年臨床報道顯示，針刺療法對血管性癡呆患者的智能及社會活動功能康復療效肯定。根據中風癡呆證患者腎虛者可占80%以上[70]，以腎虛、痰瘀內阻為證候基本特征，故以益腎填髓、醒腦啟智佐滌痰化瘀立法選穴。結合經絡理論，如《難經·二十八難》“督脈者……上至風府，入屬于腦”，周莉等[71]觀察到針刺百會可提高人的即時記憶能力及小鼠的學習成績和記憶再現能力，故針刺百會可通督醒腦。腎俞、膈俞均屬膀胱經，而“膀胱足太陽之脈，起于目內毗，上額交巔。其直者，從巔入絡腦”(《靈樞·經脈》)，腎俞可益腎填髓充腦，膈俞為八會穴之一，可活血化瘀。因此，選用這組穴位，以百會通督醒腦，腎俞益腎填髓充腦，膈俞活瘀祛痰。因此，我們的前期研究選用了百會、腎俞、膈俞穴組成益腎醒腦針法[1-7]。

研究證實，益腎醒腦針法對腦I/R 模型動物學習與記憶能力有良性影響，可以抑制模型小鼠跳臺實驗和水迷宮實驗學習與記憶能力的減退[2-3]。糖尿病大鼠腦I/R損傷可導致海馬的損傷[19]，針刺可改善糖尿病合并腦I/R 造成的學習記憶障礙，治療后神經元缺失有所減輕[62]。

前期實驗通過復制反復腦I/R 小鼠模型，海馬和皮層同時受損。術后1 d，模型小鼠海馬CA1區及皮層神經元出現凋亡，術后7 d凋亡細胞進一步增多。結合圖像分析，模型組海馬CA1區凋亡陽性細胞的場數目、面數密度、面密度均增加，即凋亡陽性細胞數目增加，細胞核固縮。

益腎醒腦針法抑制腦I/R 導致的大腦皮質和海馬神經元細胞凋亡是多途徑、多方位的。電針通過影響I/R 局灶的神經元超微結構，改善缺血病灶區域的能量供應及代謝功能，發揮對神經功能的保護作用[30]。通過動員外周血內皮祖細胞(EPCs)數量、降低誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)活性和血管內皮細胞生長因子(VEGF)的高表達，促進血管新生來改善腦缺血[68]。通過下調Bax蛋白和上調Bcl-2，抑制脊髓背根傳入神經阻滯貓神經細胞凋亡[69]。頭電針可減輕大腦中動脈閉塞再灌注后白細胞的浸潤，在一定范圍內降低血漿及缺血腦組織TNF-α和IL-1β表達，增強IL-10表達，降低損傷腦組織中COX-2、NF-κB的表達，增強轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)的表達，減緩免疫炎癥反應，減輕腦I/R 損傷，改善模型大鼠腦神經功能的恢復[63,65-66]。經電針治療7 d，反復腦I/R 小鼠的海馬及皮層神經元凋亡陽性細胞的場數目、面數密度、面密度均降低，凋亡細胞明顯減少[6-7]，即顯示電針具有抑制海馬及皮層神經元凋亡的作用。電針可通過上調海馬HSP70、c-fos、Bcl-2的表達，下調Bax表達，降低凋亡率，抑制海馬細胞凋亡，保護神經元[1,4-5]。研究發現腦I/R 組大鼠大腦皮層細胞線粒體膜電位水平明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，電針可使線粒體膜電位升高，細胞凋亡率受到抑制[22]。

總之，目前的研究結果表明，電針治療可以通過減少神經細胞凋亡，減輕腦I/R 損傷，保護神經元。但是，電針是如何由刺激通過細胞信號轉導發揮上述作用的尚不清楚。

6應用Bax基因敲除小鼠使研究深化

因Bax 蛋白的抗凋亡效應、促進細胞存活, Bax基因敲除對整體動物發育和生理功能的影響也受到了人們的關注。Sun W等[72-73]觀察了Bax 基因敲除小鼠中運動神經元對新生兒坐骨神經切斷的反應，發現海馬神經元細胞程序性的死亡被凋亡基因 Bax介導。Kim TW等[74]觀察了Bax 基因缺陷小鼠海馬齒狀回中的自發反應性星形膠質細胞情況。Suzuki H等[75]觀察了Bax 基因缺陷小鼠的背根神經節中的感覺神經元的表征。Shi J等[76]觀察了Bax 基因缺陷小鼠所致神經缺血損傷與電壓門控性鉀通道調節有關。應用Bax基因敲除小鼠使研究得到了深化。

7研究假說與思路

電針腎俞、膈俞、百會穴抑制腦I/R損傷小鼠模型的海馬神經元細胞凋亡，可能是通過JNK信號轉導線粒體通路的不同環節，抑制細胞質JNK活化，上調Bcl-2表達，下調Bax表達，抑制AIF的釋放，抑制海馬神經元細胞凋亡，并達到JNK抑制劑sp600125抗海馬神經元細胞凋亡高、中、低能力的某個水平。因此，本研究擬從腦組織、腦功能、腦線粒體形態和功能等多個層面，通過電針刺激腦I/R損傷后的Bax基因敲除小鼠，采用原位細胞凋亡檢測方法、神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組化以及流式細胞術(FCM)定量檢測大腦皮層及海馬細胞的凋亡情況，采用免疫組化方法檢測皮層及海馬神經元細胞AIF水平，光鏡和電鏡觀察線粒體的形態結構，激光共聚焦顯微鏡結合熒光分子探針技術檢測腦線粒體Ca2+以及線粒體代謝功能，同時采用RT-PCR和western blot檢測皮層與海馬組織中Bcl-2和Bax的表達，研究I/R損傷誘導腦神經元細胞凋亡的JNK信號轉導線粒體通路機制，以及電針組穴的調控作用。試圖從JNK信號轉導線粒體通路的不同環節—I/R模型、I/R特征、JNK活化、Bcl-2與Bax平衡、AIF釋放、細胞凋亡結果的多個層次，探討電針調控腦I/R損傷海馬神經元細胞凋亡的JNK信號轉導caspase非依賴的線粒體通路機制。電針抑制凋亡JNK線粒體途徑的研究假說與思路見圖5。

圖5　電針抑制凋亡JNK線粒體途徑的研究假說與思路

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(本文編輯：習沙)

※項目來源：國家自然科學基金委員會資助項目(編號：81373731)

1河北醫科大學2011級中西醫結合本科生，河北石家莊050031

Research design of regulation of electroacupuncture on the mitochondrial JNK signal pathway in cerebral ischemia-reperfusion mice with Bax gene knockoutZHAOJianxin*,TIANYuanxiang，RANQingzhi.*DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,ThirdHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029

【Abstract】ObjectiveTo study the research design of regulation of electroacupuncture on the mitochondrial JNK signal pathway in cerebral ischemia-reperfusion (I/R) mice with Bax gene knockout. Methods The research design was proved and explained by mean of research hypothesis with reference literature combined with previous research results. Results Nerve cells apoptosis can be induced by cerebral I/R injury. This signal transduction processes involve more than one gene expression and the interaction. The cell apoptosis mediated by JNK signal pathway play an important role in cerebral I/R injury. The tumor necrosis factor α(TNF-α) and interleukin 8 (IL-8) was the marker for cerebral I/R. Electroacupuncture can inhibit the apoptosis of nerve cells, reduce cerebral I/R injury, protect neurons. The application of Bax gene knockout made deepened the study. Conclusion This study illustrate the mechanism of the regulation and controlling of electroacupuncture on the JNK signal transduction caspase-independent mitochondrial pathways in cerebral I/R hippocampus neuron apoptosis which based on the Bax gene knockout mice, and explained from different aspects level covers the I/R model, I/R feature, JNK activation, the balance of Bcl-2 and Bax, AIF release and cell apoptosis.

【Key words】Cerebral ischemia; Reperfusion injury; Disease model; Animal; Acupuncture; Mitochondrion; Cell apoptosis; Interleukin

(收稿日期：2015-05-06)

作者簡介：趙建新(1968—)，女，教授，主任醫師，博士研究生導師，博士。從事針灸臨床工作。研究方向：缺血再灌注損傷。

通訊作者：△中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京100700

【中圖分類號】R743.31；R965.1；R-3；R743.31；R78；R245

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)12-1868-08

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.033