轉化生長因子-β1對新生大鼠星形膠質細胞結締組織生長因子表達的影響

李合華, 李　彤, 宋志秀

(新鄉醫學院第一附屬醫院 神經內科, 河南 衛輝, 453100)

轉化生長因子-β1對新生大鼠星形膠質細胞結締組織生長因子表達的影響

李合華, 李彤, 宋志秀

(新鄉醫學院第一附屬醫院 神經內科, 河南 衛輝, 453100)

摘要:目的觀察轉化生長因子(TGF-β1)對新生大鼠星形膠質細胞(Ast)結締組織生長因子(CTGF)表達的影響。方法采用新生SD大鼠大腦皮層Ast，以FITC細胞免疫熒光鑒定后，用含0、1、2、4 ng/mL的TGF-β1分別干預培養24 h，分別用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Wb)檢測細胞中CTGF mRNA和蛋白的表達。結果TGF-β1能顯著增加Ast中CTGF mRNA及蛋白表達；隨著TGF-β1濃度的增加，CTGF mRNA和蛋白的表達量均有升高的趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。結論TGF-β1能上調Ast中CTGF的表達，而該影響隨TGF-β1濃度增加而顯著，提示TGF-β1可以在一定程度上通過調節新生SD大鼠Ast CTGF表達導致神經膠質化。

關鍵詞:星形膠質細胞; 神經膠質化; 轉化生長因子-β1; 結締組織生長因子

神經膠質細胞增生及膠質瘢痕形成是中樞神經系統(CNS)許多疾病損傷后病理修復的共同轉歸，其機制不明[1]。反應性膠質化是CNS損傷后組織開始修復的普遍病理現象，是Ast對損傷的應激反應[2]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是腦損傷后反應性膠質細胞增生的重要因子，在周圍組織纖維化疾病中起著關鍵作用[3]，但其信號轉導通路機制不明，在Ast中TGF-β1對結締組織生長因子(CTGF)表達的誘導作用研究甚少。本研究采用RT-PCR和Wb方法觀察了TGF-β1對新生SD大鼠Ast中CTGF mRNA和蛋白表達的影響，現報告如下。

1材料與方法

1.1　材料

新生SD大鼠由新鄉醫學院實驗動物中心提供; RecombinantHumanTGF-β1、One-StepRT-PCR kit購自北京全式金生物技術有限責任公司; Rabbit anti-rat CTGF(兔抗大鼠CTGF)、HRP標記羊抗兔IgG均由美國santacruz公司生產，購自鄭州寶科生物科技有限公司；其他化學試劑均為市售分析純。

1.2　方法

1.2.1細胞培養：以McCarthy經典培養方法為基礎，并加以適當改進。將新生1～3 d內的SD大鼠脫頸處死后浸泡于酒精中，無菌條件下取出大腦，仔細剔除腦膜及血管組織，去除海馬，將大腦移入小玻璃瓶中，充分剪碎為1 mm3, 吸入離心管內, 1 500 r/min離心5 min, 棄上清液取沉淀，加入含20%胎牛血清制成DMEM懸液，吹打均勻。細胞計數后以1×105/mL的密度接種于一次性無菌培養瓶中，將培養瓶置于37 ℃、CO2體積分數為5%、濕度為95%的培養箱中培養。40 min后換培養瓶以去除成纖維細胞, 3 d后換液。培養9～14 d, 細胞融合后傳代。傳代4～8代后給予含不同濃度的TGF-β1(0、1、2、4 ng/mL)孵育。

1.2.2RT-PCR: 用RT-PCR法檢測細胞中CTGF mRNA的表達。所有引物均由Primer Premier 5.0軟件設計，上海生物工程公司合成。CTGF引物：上游: 5′-CCCGTTAGCCTCGCCTTGGT-3′, 下游: 5′-GGCAGTTGGCTCGCATCATAG-3′; GAPDH引物：上游: 5′-GTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游: 5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。以Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄后，進行PCR擴增。PCR反應條件為: 94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 min→循環35→72 ℃ 10 min。瓊脂糖電泳檢測Smad2的擴增片段為110 bp, CTGF的擴增片段為571 bp, GAPDH的擴增片段310 bp。PCR擴增產物置于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用ChemilnagerTM550型凝膠成像分析儀進行分析，用GeneTools軟件進行電泳圖像分析。以CTGF和GAPDH電泳條帶OD值的比值來表示CTGF mRNA的相對表達量。

1.2.3Wb: 用Wb法檢測細胞中CTGF蛋白的表達。用單去污劑裂解緩沖液溶解Ast, 緩沖液包括100 mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mg/L Aprotinin、10 g/L TritonX-100。溶解產物4 ℃、10 000 r/min離心10 min。蛋白定量用Bradford法測定。相同量的上清液以100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離的蛋白質轉到PVDF膜，用含1 g/L Tween20和50 g/L小牛血清白蛋白(BSA)的TTBS(100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl和137 mmol/L NaCl)室溫封閉2 h, 兔抗大鼠CTGF抗體(1∶400)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶結合的二抗(1∶4000)室溫孵育2 h。ECL檢測目的蛋白，暗室進行X光膠片曝光、顯影、和定影。用圖像分析儀(WEALTEC)掃描, Quantity One軟件檢測分析。計算各蛋白樣品的蛋白質與GAPDH顯色積分光密度比值ODFN/ODGAPDH。

2結果

2.1　TGF-β1對Ast中CTGF mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與TGF-β1共同孵育后，體外培養的Ast細胞CTGF mRNA的表達水平顯著升高，且隨著TGF-β1濃度的增加, CTGF mRNA的表達量呈上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.01), 見圖1、表1。

2.2　TGF-β1對Ast表達TGF蛋白的影響

與TGF-β1共同孵育后，體外培養的Ast細胞CTGF蛋白的表達水平顯著升高，且隨著TGF-β1濃度的增加，CTGF蛋白的表達量呈升高的趨勢，差異有統計學意義(P<0.01), 見圖2、表2。

注: M. Marker; 1. 0 ng/mL; 2. 1 ng/mL;

3. 2 ng/mL; 4. 4 ng/mL

TGF-β1/(ng/mL)n表達量FP030.504±0.019131.214±0.042**92.8680.000231.558±0.166**##431.961±0.140**##△△

與加入0 ng/mL TGF-β1相比，**P<0.01;

與加入1 ng/mL TGF-β1相比, ##P<0.01;

與加入2 ng/mL TGF-β1相比, △△P<0.01。

圖2不同濃度TGF-β1對Ast CTGF蛋白表達的影響

注: 1. 0 ng/mL; 2. 1 ng/mL;

3. 2 ng/mL; 4. 4 ng/mL

TGF-β1/(ng/mL)n表達量FP030.243±0.007131.093±0.113**119.1360.000231.598±0.063**##432.004±0.203**##△△

與加入0 ng/mL TGF-β1相比，**P<0.01;

與加入1 ng/mL TGF-β1相比，##P<0.01;

與加入2 ng/mL TGF-β1相比, △△P<0.01。

3討論

TGF-β1是目前已知公認與外周纖維化關系最密切、最具代表性的生長因子[4], TGF-β1在CNS損傷后的過度表達引起人們的關注，但其作用機制尚未完全明確。反應性膠質化與皮膚膠質瘢痕形成及其他周圍組織纖維化同屬機體組織損傷后修復過程，且神經組織與皮膚同源于外胚層[5]，其損傷后修復的病理生理學分子機制可能存在共性。考慮TGF-β1在CNS損傷后膠質化修復中起作用。

CTGF能夠刺激成纖維細胞增殖、細胞外基質產生、肉芽組織形成和纖維化[6]。在人成纖維細胞中，重組CTGF誘導纖維連接蛋白mRNA的表達和蛋白質的合成，并呈劑量依賴性關系。CTGF中和性抗體可以顯著降低但不能完全抑制這種作用。CTGF在增加ECM、促進血管形成等方面起到關鍵性的作用[7]。這些都與纖維化密切相關，說明CTGF是纖維化形成過程中的重要介質。CTGF能被數種因子轉錄激活，TGF-β1是其中最重要激活因子，主要通過Smad2/3途徑、蛋白激酶C(PKC)和Ras/MEK/ERK信號轉導途徑，在基因水平上參與CTGF的轉錄和表達[8-9]。抗CTGF的抗體和反義CTGF可分別從蛋白水平和核酸水平特異性的阻斷TGF-β對成纖維細胞的誘導作用[10]。本實驗發現TGF-β1能夠刺激Ast中CTGF的表達與合成，而且TGF-β1以劑量依賴性的方式提高CTGF mRNA和蛋白含量。因此，在CNS損傷后神經膠質疤痕形成機制中，TGF-β1是關鍵因子之一，CTGF是介導TGF-β1促纖維化作用的一個重要下游因子。

最近有研究報道[11]，抗TGF-β治療可以阻止纖維化的發生和發展，但由于TGF-β作用的靶細胞種類多，效應復雜，完全阻斷其表達或活性的后果是難以預料的。CTGF表現出與TGF-β不同的生物學活性，作用比較單一，主要介導TGF-β的促纖維化作用，并且它只在間質細胞中表達，其作用也只局限于結締組織[12]。因此，靶向CTGF治療神經膠質細胞增生及膠質瘢痕形成不影響TGF-β其他功能，是一個較阻斷TGF-β更有效和特異的靶點。

RNA干擾是最近發現和發展起來的新興的基因阻斷技術，它能高效、特異地阻抑細胞內源或外源性靶基因的表達[13-14]。研究[15]證實多種siRNA能誘導基因沉默，這提供了一種經濟、快捷和高效的基因表達抑制技術手段，進一步研究擬采用RNA干擾技術調控神經膠質化，減少并發癥及后遺癥的發生，減輕其危害。

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Influence of transforming growth factor-β1on

expression of connective tissue growth factor

in astrocytes in neonatal rat

LI Hehua, LI Tong, SONG Zhixiu

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,

Weihui,Henan, 453100)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the infhuence of transforming growth factor (TGF-β1) on connective tissue growth factor (CTGF) in astrocytes (Ast cells) of neonatal rat. MethodsAst cells were separated from neonatal SD cerebral cortex of rat and identified by FITC immunofluorescence. Ast cells were incubated in TGF-β1 for 24 hours. Concentrations of TGF-β1used in the test were 0, 1, 2 and 4 ng/mL. After that reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot were performed to defct the mRNA and protein expressions of CTGF. ResultsTGF-β1increased the mRNA and protein expressions of CTGF and the expressions up regulated along with the elevated concentrations of TGF-β1showed a significant difference (P<0.05). ConclusionTGF-β1increased the expression of CTGF in Ast cells in a concentration-dependent manner, indicating that TGF-β1can increase the expression of CTGF in Ast cells within a certain range that induces reactive astrogliosis in neonatal SD rats.

KEYWORDS:astrocytes; reactive astrogliosis; transforming growth factor -β1; connective tissue growth factor

通信作者:李彤, E-mail: litong0833@163.com

基金項目:河南省科技廳資助項目(082102310015, 112101310400)

收稿日期:2014-12-22

中圖分類號:R 338.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-005-04

DOI:10.7619/jcmp.201509002