EGFR及Mfn2在乳腺癌進展中的意義及其相關性研究

張順禮, 胡繼衛, 馬　杰, 張景華, 王　宇, 谷　崢, 陳晶晶

(1. 河北省唐山市人民醫院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中醫學院臨床醫學院, 云南 昆明, 650000)

EGFR及Mfn2在乳腺癌進展中的意義及其相關性研究

張順禮1, 2, 胡繼衛1, 馬杰1, 張景華1, 王宇1, 谷崢1, 陳晶晶1

(1. 河北省唐山市人民醫院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中醫學院臨床醫學院, 云南 昆明, 650000)

摘要:目的研究外周血線粒體融合蛋白2(Mfn2)在表皮生長因子受體(EGFR)為陽性的乳腺癌患者疾病進展中的表達情況，探討其與EGFR及乳腺癌預后的關系。方法選擇EGFR陽性乳腺癌患者44例，檢測其外周血Mfn2 mRNA表達。隨訪3年出現疾病進展時，再次檢測患者外周血Mfn2 mRNA表達情況。結果26例患者出現疾病進展，外周血Mfn2陽性表達組疾病進展率為42.1%(8/19), 陰性組疾病進展率為72.0%(18/25), 差異具有統計學意義(P<0.05); 疾病進展后，陽性組Mfn2陽性率降至52.63%(10/19), 陰性組陽性表達率為0%; 陽性組出現疾病進展患者陽性率為25.00%(2/8), 未進展患者陽性率72.72%(8/11), 差異具有統計學意義(P<0.05)。結論EGFR、Mfn2在乳腺癌的復發、轉移中發揮重要作用，聯合檢測EGFR、Mfn2可能作為監測乳腺癌進展、提高乳腺癌復發的診斷效率及預測腫瘤預后的重要生物學指標。

關鍵詞:乳腺癌; 表皮生長因子受體; 線粒體融合蛋白-2; 免疫組織化學; 逆轉錄-聚合酶鏈反應

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有57萬例乳腺癌患者發生遠處轉移[1]。乳腺癌的發生主要涉及癌基因的激活與抑癌基因的失活。中國學者陳光慧[2]等研究發現線粒體融合蛋白2(Mfn2)是一種重要的細胞增殖抑制因子，也稱為細胞增殖抑制基因(HSG)。研究認為Mfn2可能是一種高效的抑癌基因[3], Mfn2表達異常或功能缺失可能是腫瘤發生發展的重要原因[4]。表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達與腫瘤的轉移和血管形成有關[5]。本研究組前期研究發現EGFR陽性患者中Mfn2 mRNA的表達率顯著低于EGFR陰性者[6]。為進一步研究二者與疾病進展的關系，本研究選取青年乳腺癌EGFR陽性表達者，分析患者疾病進展過程中外周血Mfn2表達情況，探討EGFR與Mfn2在乳腺浸潤性導管癌患者的疾病發生發展中可能的作用及臨床意義，報告如下。

1資料與方法

選擇2011年1月—2011年10月在唐山市人民醫院進行診斷、治療的所有乳腺癌患者的臨床資料進行統計，入選標準: ① 年齡30～35歲，體質量指數20～24.9，已婚; ② 臨床資料完整，有手術病歷，根據國際抗癌協會乳腺癌TNM分期: Ⅲ期; ③ 病理診斷為浸潤性導管癌明確，并行免疫組化雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)等相關基因檢測均為陰性; ④ 無其他基礎疾病，所有患者術前未接受化療、放療。免疫組織化學法檢測乳腺癌組織，篩選出符合上述標準的EGFR陽性表達患者44例。根據手術及放化療治療后外周血中Mfn2的表達情況分為Mfn2陽性表達組19例及陰性表達組25例，隨訪3年，每3個月隨訪1次。

PCR引物：引物的設計及合成由上海生工北京測序部負責完成。引物序列如下: Mfn2引物上游5′-AGGGACTTGCCTCTCTTCTC-3′, 下游5′-TCCACCATCCATCCTTCTAC-3′; HGADPH引物上游5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′, 下游5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。

總RNA提取：分別采集患者放化療結束后及隨訪結束后(或出現疾病進展后)靜脈血液標本3～5 mL，EDTA管抗凝。人淋巴細胞分離液分離有核細胞，采用TRNzol試劑按說明書操作，經氯仿分層，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，提取總RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計測定其濃度和純度。

cDNA合成：取總RNA2 μL, 根據逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，反應條件: 1 g/L模板總RNA 2 μL, 0.5 g/L Oligo(dT) 181 μL, RNasefree ddH2O 9 μL, 70 ℃水浴5 min, 冰浴30 s, 再于試管內加入5倍Reaction Buffer 4 μL, RNase Inhibitor 1 μL, dNTP Mix 2 μL, 反應混合物于37 ℃水浴5 min, 最后加入1 μL MMuLV RT(200 U/μL), 終體積為20 μL, 42 ℃水浴60 min, 70 ℃加熱10 min結束反應，-20 ℃冷凍保存。

PCR擴增：取第一鏈cDNA 2.0 μL按PCR試劑盒組建反應，反應體系總體積25 μL。第一鏈cDNA 2.0 μL, 10 μmol上游引物1 μL, 10 μmol下游引物1 μL, 2倍PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O 8.5 μL。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下照相。

所有患者進行定期隨訪，RT-PCR法檢測疾病進展前后外周血Mfn2 mRNA的表達，比較外周血Mfn2陽性組、陰性組疾病進展率及疾病進展前后Mfn2陽性表達率變化。

2結果

2.1　RT-PCR檢測Mfn2 mRNA表達

HGADPH產物為296 bp，Mfn2的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳可見大小約143 bp左右的特異性條帶，見圖1, 符合目的基因片段大小。

注:1.DNAmarker;2.外周血Mfn2mRNA陽性表達圖1 PCR擴增后Mfn2mRNA的表達

2.2　外周血Mfn2陽性組及陰性組疾病進展率比較

至2014年10月，共26例乳腺癌患者疾病臨床證實遠處轉移或局部復發，外周血Mfn2陽性表達組疾病進展率為42.1%(8/19), 陰性組疾病進展率為72.0%(18/25), 差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3　疾病進展后2組患者Mfn2陽性表達率比較

在限定除外其他相關因素影響下，疾病進展后，陽性組Mfn2陽性率降至52.63%(10/19), 陰性組陽性表達率為0; 陽性組發生疾病進展患者Mfn2陽性率為25.00%(2/8), 未進展患者陽性率72.72%(8/11), 差異具有統計學意義(P<0.05)。

3討論

乳腺癌的發生是一個復雜的多因素、多步驟的病理生理過程[7-8]。青年乳腺癌具有發展快、侵襲性高、預后差等特點[9]。有文獻報道Mfn2在乳腺癌組織中的表達水平較正常組織降低，Mfn2低表達可能與乳腺癌的發生有關，且通過下調Mfn2表達量可能會增加乳腺癌患病風險[10]。研究發現Mfn2表達異常或功能缺失可能是腫瘤發生的重要原因[11]。隨著Mfn2抑制細胞增殖作用的發現，人們開始關注它在抗腫瘤方面發揮的作用[12]。付玉環等[13]研究發現乳腺癌Mfn2表達率較癌旁正常乳腺下降，且乳腺癌Mfn2表達與組織學分級、淋巴結轉移和雌激素受體有關，可作為判斷乳腺癌生物學行為的良好指標。EGFR及其配體EGF可啟動Ras-Raf-MAPK信號轉導途徑，其對細胞生長、增殖、發育分化及癌細胞產生起重要作用,EGFR高表達會促進腫瘤細胞的增殖、黏附、轉移以及血管生成，抑制腫瘤細胞的凋亡，進而促進腫瘤的進展，而該途徑可被Mfn2抑制，導致EGFR表達下調[15]。Ratchford等[14]研究指出EGFR高表達的腫瘤患者易發生轉移，且復發率高、存活期短。

本研究組前期研究結果顯示乳腺癌EGFR陽性患者Mfn2表達率顯著低于EGFR陰性者，故本研究通過入組篩選，選擇EGFR受體陽性乳腺癌患者，降低或去除其他多因素的影響,定期隨訪其3年內疾病進展情況，結果顯示，乳腺癌組織EGFR受體陽性情況下，外周血Mfn2表達陰性組疾病進展率顯著高于外周血中Mfn2表達陽性組，與文獻報道一致[16], 疾病進展后，陽性組Mfn2陽性率降低，陽性組疾病進展患者陽性率明顯低于未進展患者陽性率。分析認為，EGFR的高表達可能會引起Mfn2表達異常或功能缺失，從而引起隨訪3年后乳腺患者疾病進展后的外周血Mfn2 mRNA的陽性表達率下降，而外周血Mfn2陽性表達一定程度上可抑制EGFR及其配體EGF啟動信號轉導途徑，從而使EGFR表達下調，在一定程度上減緩腫瘤進展。

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Significance and the relevance study of EGFR

and Mfn2 in the progression of breast cancer

ZHANG Shunli1, 2, HU Jiwei1, MA Jie1, ZHANG Jinghua1, WANG Yu1,

GU Zheng1, CHEN Jingjing1

(1.DepartmentofBreastCancer,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001;

2.SchoolofClinicalMedicine,YunnanUniversityofTCM,Kunming,Yunnan, 650000)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression of peripheral blood Mitochondria fusion protein-2 (Mfn2) in the disease progression of breast cancer patients with positive epidermal growth factor receptor (EGFR) and to explore its relationship with EGFR and the prognosis of patients with breast cancer. MethodsEGFR expression in the cancerous tissue of patients with breast cancer was detected by histoimmunochemical method, in which 44 patients with positive expression of EGFR were selected. The expression of peripheral blood mfn2 mRNA was detected, which was re-detected when disease progressed after 3 years-follow-up. ResultsOf all patients, 26 patients had disease progression. The disease progression rates in positive and negative expression groups of peripheral blood Mfn2 were 42.1% (8/19) and 72.0% (18/25), respectively, and the difference was significant (P<0.05). After disease progression, the positive expression rates of Mfn2 in positive and negative expression groups decreased to 52.63% (10/19) and 0%. And the positive rates of patients with disease progression in positive expression group and non-disease progression group were 25.00% (2/8) and 72.72% (8/11), respectively, and the differences were significant (P<0.05). ConclusionEGFR and Mfn2 play an important role in the recurrence and metastasis of breast cancer, and their joint detection can be used as an critical biological marker for the surveillance of disease progression and promote the diagnostic rate of the recurrence and the prognosis of breast cancer.

KEYWORDS:breast cancer; epidermal growth factor receptor; Mitochondria fusion protein-2; histoimmunochemical method; reverse transcription-polymerase chain reaction

通信作者:張景華, E-mail: jhzh2010@163.com

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11321419)

收稿日期:2014-12-25

中圖分類號:R 737.9

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-059-03

DOI:10.7619/jcmp.201509017