ID1在3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及其意義

任　力, 魏子龍, 邱永明, 蘭　津, 郭　品

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

ID1在3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及其意義

任力1, 魏子龍1, 邱永明2, 蘭津2, 郭品2

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

摘要:目的研究DNA結(jié)合分化抑制因子1(ID1)在3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平，探討其表達(dá)水平差異與放療敏感性之間可能存在的聯(lián)系。方法利用Real-time PCR以及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測T98G、A172、U251 這3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中ID1的mRNA以及蛋白表達(dá)水平，比較其表達(dá)差異。結(jié)果3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中, IDl mRNA表達(dá)情況為T98G

關(guān)鍵詞:DNA結(jié)合分化抑制因子; 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤; 放療敏感性; 蛋白質(zhì)印跡法

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，屬WHO IV級，占成人顱內(nèi)腫瘤的25%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長速度快、病程短、預(yù)后差，病程超過1年者僅占10%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以手術(shù)、放療、化療及其他綜合治療為主，放射治療是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要手段之一，但在不同患者中療效差異較大，這可能與腫瘤細(xì)胞對輻射的敏感性不同有關(guān)，這也被稱為輻射敏感性差異[1]。在作者先前的研究中發(fā)現(xiàn)，3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系對放射治療的敏感性為: T98G

1材料與方法

1.1　材料

實驗所用的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞A172、T98G、U251購自美國菌種保藏中心(ATCC)。T98G培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，購自Invitrogen公司。A172和U251培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，購自Invitrogen公司。Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒(BcaBESTTM RNA PCR Kit和SYBR Premix Ex TaqTM)均購于Takara公司；Real-time PCR引物由Takara公司設(shè)計合成。DEPC水自行配制，高壓滅菌，室溫保存。胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Solarbio公司。ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司, NC膜購自密理博公司，暗盒、膠片、顯色液等購自碧云天公司。IDl抗體購自美國Santa Cruze公司。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：所有細(xì)胞都置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)上述3種細(xì)胞A172、T98G、U251，使之處于對數(shù)生長期的階段。

1.2.2Real-time PCR法檢測3種人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中IDl mRNA的相對定量：目的基因IDl擴(kuò)增引物序列為正向5′-ACGACATGAACGGCTGTTACTCAC-3′，反向5′-CTCCAACTGAAGGTCCCTGATGTAG-3′, 125 bp。內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增引物序列為正向5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′, 反向5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′, 89 bp。按標(biāo)準(zhǔn)方法提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time PCR反應(yīng)及融解曲線分析，計算mRNA的相對定量。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測3種人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中IDl蛋白的表達(dá)：胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Solarbio公司。ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司, NC膜購自密理博公司，暗盒、膠片、顯色液等購自碧云天公司。IDl抗體購自美國Santa Cruze公司。待細(xì)胞長滿后，將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3次，每孔加入30 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min, 4 ℃, 12 000 g離心20 min, 將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用考馬斯亮藍(lán)法(Brandford)測定蛋白含量。15% SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，膜的封閉，抗原抗體反應(yīng)，掃膜。

2結(jié)果

3種細(xì)胞系中，IDl mRNA表達(dá)情況為T98G

圖1 3種細(xì)胞系中ID1的mRNA的表達(dá)情況

圖2 3種細(xì)胞系中ID1蛋白的表達(dá)情況

3討論

放射治療是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要手段之一[7]，如何增強(qiáng)此類患者的放射治療效果是當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點之一[8]。最初主要從放射劑量的角度考慮來增強(qiáng)放射治療效果，當(dāng)放射劑量從50 Gy增加到60 Gy的時候，治療效果有明顯提高。而從60 Gy提高到70 Gy的時候，放射治療的效果無明顯改善。所以，試圖單純從提高劑量這個角度，無法增強(qiáng)放射治療的效果。隨著分子生物學(xué)以及腫瘤基因?qū)W的不斷進(jìn)展，尋找新的腫瘤治療靶點成為目前研究者關(guān)注的重點[9]。對影響放射治療敏感性的相關(guān)因子研究成為近年來腫瘤放射治療的熱點之一。在對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射治療的研究中，亦是如此[10]。

眾所周知，同一輻射劑量對不同細(xì)胞造成的損傷有很大的不同。在相同劑量照射下，不同的細(xì)胞所受的損傷會有所不同，這可能與細(xì)胞對輻射的敏感性不同造成的，這也被稱為輻射敏感性差異[10]。因此患不同腫瘤的患者，甚至患有同一種類型腫瘤的不同患者，其放療療效也大不相同。如能在放療前預(yù)先知道其輻射敏感性的高低，則有利于放療方案的制定和決策，從而有針對性地提高各個患者的療效，并可更合理的分配醫(yī)療資源。因此，研究腫瘤細(xì)胞中與放療敏感性相關(guān)的因素就顯得尤為重要。

ID蛋白是螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，它與堿性HLH蛋白等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成異二聚體后，抑制bHLH與DNA的結(jié)合，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。ID蛋白通常分布于胚胎及未分化成熟的組織中，成人體內(nèi)在胸腺、生殖腺中有微量表達(dá)，正常細(xì)胞內(nèi)蛋白量隨著細(xì)胞分化過程逐漸降低。早期關(guān)于ID蛋白的研究主要集中于它對細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，但是隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)ID蛋白在多種惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)趨勢，且其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的惡性程度、腫瘤的發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，提示惡性腫瘤ID基因的表達(dá)異常，可能是腫瘤侵襲性表型、預(yù)后差的標(biāo)志，并有望成為腫瘤治療的靶標(biāo)[12-13]。ID1是目前研究的最多最深入的蛋白，在許多原始的成纖維細(xì)胞中，ID1通過激活Ras/Raf/MEK途徑促進(jìn)增殖從而逃避衰老[14]。ID1蛋白異常表達(dá)于多種腫瘤組織中，與腫瘤的生長、侵襲、血管生成及預(yù)后等密切相關(guān)[4]。在各類腫瘤細(xì)胞中，ID1都是腫瘤增殖的正性調(diào)控基因，可通過抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。

本研究從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平雙重證實3種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中ID1的表達(dá)情況為：T98G

參考文獻(xiàn)

[1]尹麗, 朱廣迎. 腫瘤放射敏感性影響因素的研究進(jìn)展[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2012, 19(8): 629.

[2]Shen Y, Wang Y, Sheng K, et al. Serine/threonine protein phosphatase 6 modulates the radiation sensitivity of glioblastoma[J]. Cell death & disease, 2011, 2(12): e241.

[3]王川, 洪天姿, 張捷, 等. 分化和 DNA 結(jié)合抑制因子 1 基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞株 MCF-7 增殖活性及分泌血管內(nèi)皮生長因子的影響[J]. 中華實驗外科雜志, 2012, 29(05): 841.

[4]Zhao Z R, Zhang Z Y, Zhang H, et al. Overexpression of Id-1 protein is a marker in colorectal cancer progression[J]. OncolRep, 2008, 19(2): 419.

[5]Ponz-Sarvise M, Nguewa P A, Pajares M J, et al. Inhibitor of differentiation-1 as a novel prognostic factor in NSCLC patients with adenocarcinoma histology and its potential contribution to therapy resistance[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(12): 4155.

[6]Diaz R, Nguewa P A, Diaz-Gonzalez J A, et al. The novel Akt inhibitor Palomid 529 (P529) enhances the effect of radiotherapy in prostate cancer[J]. Br J Cancer, 2009, 100(6): 932.

[7]Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med, 2005, 352(10): 987.

[8]Wen P Y. New developments in targeted molecular therapies for glioblastoma[J]. Expert Rev Anticancer Ther[J]. 2009, 9(1):7.

[9]McLendon R, Friedman A, Bigner D, et al. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways[J]. Nature, 2008, 455(7216): 1061.

[10]劉永貴, 楊智勇, 王廷華. 膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其干細(xì)胞的放療敏感性差異[J]. 四川解剖學(xué)雜志, 2013, 20(3): 1.

[11]Norton J D. ID helix-loop-helix proteins in cell growth, differenti-ation and tumorigenesis[J]. J Cell Sci, 2000, 113(22): 3897.

[12]雷婷, 韓霜, 郭雪艷, 等. 由 Id1 介導(dǎo)的 MMP-2, MMP-9 對胃癌生成的調(diào)控作用[J]. 中國癌癥雜志, 2012, 21(7): 555.

[13]Fong S, Debs R J, Desprez P Y. Id genes and proteins as promising targets in cancer therapy[J]. Trends Mol Med, 2004, 10(8): 387.

[14]Lee T K W, Man K, Ling M T, et al. Over-expression of Id-1 induces cell proliferation in hepatocellular carcinoma through inactivation of p16INK4a/RB pathway[J]. Carcinogenesis, 2003, 24(11): 1729.

[15]呂峰, 李永團(tuán). Cyclin D1在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義[J]. 山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報, 2013, 27(2): 13.

Expression and its significance of ID1

in three types glioblastoma cell line

REN Li1, WEI Zilong1, QIU Yongming2, LAN Jin2, GUO Pin2

(1.DepartmentofNeurosurgeryShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399; 2.Department

ofNeurosurgeryRenjiHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicineinShanghaiJiaotong

University,Shanghai, 200127)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression level of Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1) in glioblastoma cell line and to analyze the relationship between ID-1 expression level and radiosensitivity. MethodsReal-time PCR and immunoblotting were used to detected the expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line (T98G, A172 and U251) and the expression differences were compared. ResultsThe sequence of the mRNA expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line was T98G

KEYWORDS:Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1); glioblastoma; radiosensitivity; immunoblotting

通信作者:魏子龍, E-mail: weizilong2007@163.com

基金項目:上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會科技發(fā)展專項基金(PW2013A-19)

收稿日期:2014-12-23

中圖分類號:R 730.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-062-03

DOI:10.7619/jcmp.201509018