重慶地區膀胱癌人群IL-23R rs10889677位點單核苷酸多態性與膀胱癌易感性的相關性分析

曹全富, 葉　錦, 付成偉, 馮慶興, 張　軍, 張克勤

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所 泌尿外科, 重慶, 400042)

重慶地區膀胱癌人群IL-23R rs10889677位點單核苷酸多態性與膀胱癌易感性的相關性分析

曹全富, 葉錦, 付成偉, 馮慶興, 張軍, 張克勤

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所 泌尿外科, 重慶, 400042)

摘要:目的分析白介素23受體(IL-23R)基因rs10889677位點單核苷酸多態性(SNPs)與重慶地區膀胱癌人群易感性的相關性。方法選取來自重慶地區的膀胱癌組患者210例和健康對照組人群200例，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測IL-23R rsl10889677位點SNPs并分析其與膀胱癌的關系。結果IL-23R基因rs10889677位點存在三種基因型(AA型、AC型和CC型)，在膀胱癌組和對照組中的基因型頻率分布差異有統計學意義(χ2=17.45,P<0.01); 膀胱癌組攜帶等位基因A的頻率(75.71%)明顯增高對照組基因型(65.50%), 差異有統計學意義[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。結論IL-23R rs10889677位點基因多態性與重慶地區膀胱癌易感性相關。

關鍵詞:白介素-23受體; 單核苷酸多態性; 易感性; 相關性; 膀胱癌

膀胱癌是一種嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，其發病率為中國泌尿系腫瘤第一位，且有逐年增長趨勢[1]。國內外研究[2-3]證實慢性炎癥與惡性腫瘤的發生密切相關，二者在多方面具有相似性，如免疫細胞浸潤、基質金屬蛋白酶活性升高、血管增生和脈管系統密度提高[4]。白介素23受體(IL-23R)基因是與炎癥、腫瘤等疾病發病相關的細胞因子[5]。但IL-23R基因rs10889677位點SNPs是否與重慶地區膀胱癌人群發病有關尚不明確，故本研究將采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術對IL-23R基因rs10889677位點進行SNPs檢測并分析該位點SNPs與重慶地區人群膀胱癌的相關性，為探索IL-23R基因與膀胱癌的發病機制提供理論依據。

1資料與方法

選擇2010年10月—2013年5月年本院泌尿外科收治的重慶地區210例膀胱癌患者為病例組，經病理確診。其中男158例，女52例，平均年齡(64.5±10.5)歲，吸煙者92例，不吸煙者118例；上述病例均為初診膀胱癌患者，不包括膀胱癌復發患者，未經化療、放療，并且無任何其他腫瘤病史；腫瘤組織病理診斷為膀胱移行細胞癌，其中淺表性(Ta期～T1期)為148例，浸潤性(T2期～T4期)為62例。對照組200例，來自本院同期健康體檢者，其中男116例，女84例，平均年齡(62.7±9.5)歲，吸煙者74例，不吸煙者126例，無慢性疾病、無泌尿系統疾病、無任何惡性腫瘤家族史，最終排除診斷膀胱腫瘤及其他部位惡性腫瘤。上述2組研究對象均未接受其他免疫抑制劑治療，未合并其他自身免疫性疾病、病毒性肝炎和HIV感染。全部研究對象經本院倫理委員會同意，簽署知情同意書。

PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)、限制性內切酶均購自美國Fermentas公司，MarkerDP500TM為大連寶生物生物工程有限公司生產。主要儀器有PCR擴增儀為德國Eppendorf公司產品，高速低溫離心機購自德國Eppendorf公司，電泳儀產自北京六一儀器廠，全自動凝膠成像儀購自美國SYNGENE公司。

采集研究對象外周血2 mL(血常規管抗凝)，采用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，按說明書操作，在紫外分光光度儀上(OD260/OD280)進行核酸定量，最后將提取的DNA稀釋至20 ng/μL, -20 ℃保存待用。

rs10889677的PCR引物參照文獻[6]設計，由上海生工公司合成。rs10889677位點PCR引物序列為F: 5′-CTGTGCTCCTACCATCACCA-3′, R: 5′-TGCTGTTTTTGTGCCTGTATG-3′。25 μL PCR反應體系包括DNA 20 μL, 上下游引物(1.0 μmol/L)各1 μL, Dream TaqTM PCR Master Mix(2×)12.5 μL, 滅菌去離子水8.5 μL。PCR反應為先95 ℃ 2 min, 接著95 ℃ 20 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35個循環，最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產物用DraI限制性酶37 ℃酶切過夜, 20 μL反應體系包括PCR產物10 μL、限制性內切酶(10 U/μL) 1 μL, 反應緩沖液2 μL, 滅菌去離子水7 μL。酶切產物用3 g/dl瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠電泳成像分析系統觀察、判定基因型。

根據已知的引物對能否擴增目的片段，來確定該等位基因的存在與否，即分別經不同的引物對擴增2次后，PCR產物經電泳確定基因型；為了提高PCR-RFLP方法的準確性，隨機抽取10%標本，送上海生工進行測序驗證，結果吻合。

2結果

2.1　一般資料

2組的性別、年齡、體質量、BMI、吸煙狀態差異均無統計學意義(P均>0.05), 具有可比性。見表1。

表1　2組一般資料比較

2.2　IL-23R rs10889677位點多態性與膀胱癌發病相關性分析

經卡方檢驗，膀胱癌組與對照組中rs10889677位點基因型和基因頻率具有顯著差異(P<0.01); 膀胱癌攜帶等位基因A的頻率(75.71%)明顯增高對照組基因型(65.50%), 差異有統計學意義[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。見表2。

表2　IL-23R rs10889677位點基因型及等位基因

3討論

目前越來越多的研究證實慢性炎癥是腫瘤發生的病理基礎。慢性炎癥促進細胞增殖，其中在富含炎性細胞、生長因子和DNA損傷誘導劑的微環境中更可以明顯增加癌癥發病的風險[7]。炎性因子、生長因子、炎癥趨化因子、活性氧(ROS)和環氧合酶2(COX2)的相互作用，在炎癥發生發展的中以一種復雜的方式發揮交互作用[8]。膀胱癌是遺傳因素和環境因素長期共同作用的結果，慢性炎癥可能作為膀胱癌發生的危險因素也已得到證實[9]。IL-23R是一個新的促紅細胞生成素受體家族成員，由IL-11和IL-23R兩個亞基構成[10]。IL-23通過結合細胞膜表面 IL-23R復合物發揮其生物效應，刺激細胞內信號傳導系統來誘導細胞激活。IL-23有促炎癥反應活性，通過STAT3信號通路激活并刺激記憶性CD4+T細胞增殖，趨化炎癥細胞聚集與遷移，在多種炎癥病灶中都有p40和p19mRNA高表達[11]。IL-23可以誘導激活的CD4+記憶T細胞產生IFN-7; 也能激發樹突狀細胞和單核細胞產生IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)，參與先天性免疫反應；并能刺激樹突狀細胞自分泌產生IL-12[12]。而IL-12只激活Th0細胞(幼稚T細胞)和自然殺傷細胞產生以IFN-γ為主的細胞因子[13]。IL-23誘導的炎癥反應過程如血管生成和巨噬細胞、中性粒細胞的浸潤是細菌感染的有效防御機制[5]。但是這個調節通路似乎對于腫瘤的預防并不合適，反而為腫瘤提供了一個保護性環境。

本研究首次探討了重慶地區膀胱癌人群IL-23R基因rs10889677位點多態性與膀胱癌遺傳易感性的關系。研究發現IL-23R rs10889677基因型可增加膀胱癌的患病風險。此外，作者也觀察到攜帶等位基因A的人群更傾向性于患有膀胱癌。基因序列中單個核苷酸的替代、插入或缺失，都會引起編碼氨基酸的改變或導致轉錄的mRNA剪接的改變，影響基因表達與蛋白質的功能從而導致疾病的發生。IL-23Rrs10889677單核苷酸多態性可能促使受體的過表達，IL-23R與蛋白酪氨酸激酶(JK2)相連，同時也促進信號轉導和轉錄激活子(STAT3)以配體依賴方式結合，使其磷酸化和隨之而來的二聚化，觸發下游基因的表達，如IL-17及IL-22[14]。IL-23R可誘導幼稚的CD4+T細胞向Thl7細胞亞群分化[15], Thl7細胞在受到刺激后可高表達IL-17, 有利于病原體的清除組織炎癥。IL-17是一個強促炎癥細胞因子，組織中過量表達的IL-17會引起慢性炎癥反應與組織損傷[16]。因此, IL-23R可能促進炎癥、癌癥的患病風險[17-18]。全基因組研究發現，rs10889677與口腔癌[19]、乳腺癌[20]和卵巢癌[2]的發生有密切關系。此外, IL-23R基因多態性與食管癌、胃癌等的研究已證實IL-23R可能與某些炎癥相關的腫瘤易感性有關。Zhang等[2]研究發現, IL-23R可通過交替剪接產生剪接異構體，并優先在肺癌中表達，進而推測該表達可能有助于細胞逃避機體的免疫監視或攻擊，使IL-23R可能在某些癌癥的發生、發展過程中發揮作用。Chen和Hsich[21]的研究證實，IL-23R信號通路中STAT3調控多種與細胞增殖及凋亡有關的功能蛋白的表達，STAT3的異常活化是引起某些癌癥的原因之一。所有這些發現表明，rs10889677的單核苷酸多態性可能有助于IL-23信號通路的調節并最終導致易感某些疾病。盡管如此，IL-23R的單核苷酸多態性和IL-23R的轉錄和表達還需待進一步研究。

參考文獻

[1]韓蘇軍, 張思維, 陳萬青, 等. 中國膀胱癌發病現狀及流行趨勢分析[J]. 癌癥進展, 2013, (1): 89.

[2]Zhang Z, Zhou B, Zhang J, et al. Association of interleukin-23 receptor gene polymorphisms with risk of ovarian cancer[J]. Cancer Genetics and Cytogenetics, 2010, 196(2): 146.

[3]李金科, 胡麗娜. NF-B與慢性炎癥和癌癥的關系及在宮頸癌的研究進展[J]. 華西醫學, 2007, (4): 915.

[4] John L Langowski, Xueqing Zhang, Lingling Wu, et al. IL23 promoted tumour incidence and growth[J]. Nature, 2006, 442: 461.

[5]楊沫毅, 向旭東. 白介素23及其受體的致炎機能[J]. 國際呼吸雜志, 2010, (2): 99.

[6]Tang Tielong, Xue Hui, Cui Shu. Association of interleukin-23 receptor gene polymorphisms with risk of bladder cancer in Chinese[J]. Familial Cancer, 2014, 32: 231.

[7]Balkwill F, Mantovani A. In?ammation and cancer: back to Virchow[J]. Lancet, 2001, 357(9255): 539.

[8]Macarthur M, Hold G L, El-Omar E M. In-ammation andcancer II. Role of chronic in?ammation and cytokine gene polymorphisms in the pathogenesis of gastrointestinal malignancy[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004, 286(4): 515.

[9]胡毅. 炎癥因子與膀胱癌發生的關系[D]. 吉林大學, 2006: 8.

[10]林慶海, 王揮戈. 白介素-23的生物活性與炎癥性疾病關系研究現狀[J]. 山東大學耳鼻喉眼學報, 2007, (1): 86.

[11]李艷春, 魯繼榮. 白介素-23的生物學功能[J]. 臨床兒科雜志, 2010, 28(3): 295.

[12]杜國盛, 石炳毅. 白介素-23的生物活性與免疫調節[J]. 中華肝膽外科雜志, 2009, (10): 788.

[13]CS. Lankford and David M. A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity[J]. Journal of Leukocyte Biology, 2003, 73(1): 49.

[14]Parham C, Chirica M, Timans J et al. A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12R beta1 and anovel cytokine receptor subunit, IL-23R[J]. J Immunol, 2002, 168(11): 5699.

[15]Daniel Wendling, Jean-Pierre Cedoz, Evelyne Racadot. Serum and synovial fluid levels of p40 IL12/23 in spondyloarthropathy patients[J]. Clin Rheumatol, 2009, 28( 2): 187.

[16]巴羅, 劉亞峰. IL-17及其相關因子在呼吸道炎癥疾病中的研究進展[J]. 華西醫學, 2008, (2): 401.

[17]Chu H, Cao W, Chen W, et al. Potentially functional polymorphisms in IL-23 receptor and risk of esophageal cancer in a Chinese population[J]. International Journal of Cancer, 2012, 130: 1093.

[18]Chen J, Lu Y, Zhang H, et al. A nonsynonymous polymorphism in IL23R gene is associated with risk of gastric cancer in a Chinese population[J]. Molecular Carcinogenesis, 2010, 49:862.

[19]Chien M H, Hsin C H, Chou L S, et al. Interleukin-23receptor polymorphism as a risk factor for oral cancer susceptibility[J]. Head Neck, 2002, 34(4): 551.

[20]Wang L, Liu W, Jiang W et al. A miRNA binding sitesingle-nucleotide polymorphism in the 30-UTR region of the IL23R gene is associated with breast cancer[J]. PLoS ONE, 2012, 7(12): 49823.

[21] Newton RC, Beral V, Weiss R. Imperial Cancer Research Fund(Great Britain), Infections and human cancer[J]. Plainview:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009: 12.

Analysis in correlation between polymorphism of

IL-23R gene rs10889677 and susceptibility

of bladder cancer in Chongqing area

CAO Quanfu, YE Jin, FU Chengwei, FENG Qingxing, ZHANG Jun, ZHANG Keqin

(DepartmentofUrinarySurgery,DapingHospitalofTheThirdMilitaryMedical

University,Chongqing, 400042)

ABSTRACT:ObjectiveTo analyze the correlation between the polymorphism of IL-23R gene rs10889677 SNPs and susceptibility of bladder cancer in Chongqing area. MethodsA total of 210 bladder cancer patients (bladder cancer group) and 200 healthy people (control group) were selected. The rs10889677 SNPs was analyzed by restriction fragment length poly(PCR-RFLP), and its relationship with bladder cancer was analyzed as well．ResultsThere were three kinds of genotypes in IL-23R gene rs10889677 (AA, AC and CC). In the three single nucleotide polymorphisms of IL-23R, the distributions of genotype and allele frequencies of rs10889677 differed significantly between the bladder cancer group and the control group. The frequency of allele A of rs10889677 in the bladder cancer group was 75.71%, which was significantly higher than 65.50% in the control group, and there was significant difference [χ2=19.28,P<0.01, odds ratio=1.952, 95% confidence interval (1.451～2.620)]. ConclusionThe rs10889677 of IL-23R gene is associated with susceptibility of bladder cancer in Chongqing area.

KEYWORDS:interleukin 23 receptor; single nucleotide polymorphisms; susceptibility; correlation; bladder cancer

通信作者:葉錦, Email: yejin7566@hotmail.com

收稿日期:2015-01-11

中圖分類號:R 737.14

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-073-03

DOI:10.7619/jcmp.201509021