DNA-SNP等位基因比率分析快速診斷產前唐氏綜合征

張有成, 張志軍, 潘國珍, 李　嵐, 馮　燕

(貴州省人民醫院 婦產科, 貴州 貴陽, 550002)

DNA-SNP等位基因比率分析快速診斷產前唐氏綜合征

張有成, 張志軍, 潘國珍, 李嵐, 馮燕

(貴州省人民醫院 婦產科, 貴州 貴陽, 550002)

摘要:目的探討羊水胎兒上皮細胞DNA-單核苷酸多態性(SNP)等位基因比率分析法快速診斷產前唐氏綜合征的效果。方法選取產前診斷為21三體單胎妊娠的凍存羊水標本24例及產前診斷為二倍體單胎妊娠的標本76例。利用基質輔助激光吸收離子化時間飛行質譜技術(MALDI-TOF)對位于21號染色體上的一個SNP位點，rs7844進行了雜合度的檢測，對雜合子樣本進行等位基因比率分析。結果100例羊水標本中，檢出rs7844雜合子樣本26例，其中21三體6例，二倍體20例。DNA-SNP等位基因比率分析診斷產前唐氏綜合征只需1～2 d, 但診斷敏感性可達100%。結論羊水細胞DNA-SNP等位基因比率分析可達到快速診斷產前唐氏綜合征的目的。

關鍵詞:羊水細胞; 單核苷酸多態性; 產前診斷; 唐氏綜合征

唐氏綜合征是最常見的先天性智力低下性疾病[1], 因為缺乏有效的治療方法，所以該病的出生前診斷及處理顯得尤為重要。目前，用來控制唐氏綜合征發病率的出生前檢測方法主要有血清學篩查[2]、超聲篩查[3]、非整倍體無創產前檢測[4]、通過絨毛活檢或羊膜腔穿刺獲取胎兒細胞進行核型分析[5]或分子生物學檢測[6]等。迄今為止，絨毛或羊水細胞核型分析仍然是產前診斷唐氏綜合征的金標準[7]，其中應用最多的是中孕期羊水細胞核型分析。該檢測方法雖然取材方便，結果可靠，但也有其不足的地方。一是從取材到得到檢查結果，一般要花費3～4周的時間，使孕婦不得不度過一段非常焦慮、極其難熬的日子；還有一少部分孕婦因孕周過大，錯過了體外羊水細胞培養的最佳取樣時間，失去了檢查的機會。因此有必要發現一種快速而又不需顧忌羊水細胞取樣時間的產前診斷方法。本研究探討一種無需進行羊水細胞體外培養就能對唐氏綜合征進行快速產前診斷的分子生物學方法，現報告如下。

1資料與方法

1.1　羊水標本的采集與分類

羊水標本來源于2011年7月—2013年7月在本院實施產前診斷的孕婦，孕周16～27周，平均孕周21.5周，均為單胎妊娠。每例孕婦在進行羊膜腔穿刺時抽取羊水23 mL, 其中20 mL用來做細胞核型分析，另外3 mL標記可查詢樣本號后于-80 ℃冰箱凍存，作為實驗用標本。實驗時，選取已有明確細胞核型分析結果的凍存羊水標本100例，分成2組，其中實驗組包括所有的21三體標本，共計24例；另外，隨機選取76例二倍體樣本作為對照組。

1.2　MALDI-TOF檢測羊水標本rs7844雜合度

100份羊水標本于室溫解凍后，采用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取羊水細胞基因組DNA。在GenBank上選取21號染色體上一個雜合度較高的SNP，rs7844作為檢測對象，應用MALDI-TOF檢測該SNP的基因型分布情況。檢測步驟包括聚合酶鏈反應(PCR)擴增樣本DNA，單堿基延伸以及質譜檢測延伸產物。PCR所用引物以及單堿基延伸所用寡核苷酸見表1。

表1　PCR所用引物以及單堿基延伸所用寡核苷酸

注：ACGTTGGATG為10 mol的附加鏈，以防止
質譜檢測時誤把剩余的引物當做單堿基延伸產物；
延伸產物中黑體字母為被延伸的SNP堿基。

1.2.1PCR擴增: 100份羊水細胞的DNA樣本進行384孔反應表編制，注明每孔對應的DNA樣本的編號。每孔反應體系5 μL, 包括10×Buffer 0.625 μL, MgCl2(25 mM)0.325 μL, 脫氧核苷酸(dNTP) 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, TaqDNA聚合酶(QIAGEN公司) 0.1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 0.95 μL。反應條件為: 94 ℃預變性15 min; 45個循環的94 ℃變性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min及72 ℃終末延伸3 min。產物4 ℃保存。

1.2.2單堿基延伸：PCR產物在延伸反應前，先進行堿基磷酸酶反應去除多余的dNTP。然后每孔中加入2 μL的延伸反應液，包括: 10×Buffer 0.2 μL, 反應終止液0.2 μL, 延伸引物0.804 μL，酶(SEQUENOM公司)0.041 μL, ddH2O 0.755 μL。反應條件為: 94 ℃預變性30 s; 40個循環的94 ℃變性5 s、52 ℃退火5 s、80 ℃延伸5 s; 每次變性反應后，退火及延伸進行5次循環后再進入下一次變性反應，以使底物充分反應。循環完成后72 ℃終末延伸3 min。產物4 ℃保存。

1.2.3檢測：延伸產物在檢測前，先用樹脂純化產物，以去除多余的鹽離子。然后將反應產物轉移到質譜檢測芯片上，即可放入質譜儀進行檢測，每個檢測點只需3～5 s, 全自動分析，獲得各個樣本的等位基因型。

1.3　DNA-SNP等位基因比率分析

對質譜檢測出的雜合子樣本進行等位基因比率分析。雜合子樣本的質譜檢測峰中，用質量較小的等位基因的峰面積除以質量較大的等位基因的峰面積計算出等位基因比率。然后對21三體組和二倍體組的等位基因比率值進行比較分析。

2結果

2.1　100份羊水標本的rs7844基因型分布情況

MALDI-TOF檢測結果可見, rs7844 SNP純合子在質譜檢測峰圖中只有一個峰，而雜合子則呈雙峰表現。通過質譜SNP分型檢測，在所檢測樣本人群中，只發現兩種rs7844等位基因型，分別是G/G及C/G。100例樣本中檢出rs7844雜合子樣本26例，其中21三體6例，二倍體20例，雜合度為26%。

2.2　21三體組與二倍體組等位基因比率值比較分析結果

2組等位基因比率值比較分析結果可見，21三體組的等位基因比率值都背離于二倍體組的等位基因比率值。二倍體組的參考區間為1.244-0.710，以這個區間的最小值作為二倍體組的下限，則所有的21三體組樣本的比率值都位于這個下限外，診斷敏感性達到了100%。

3討論

本實驗借助于時間飛行質譜技術的SNP分型及定量檢測的性能[8-9]，通過對羊水細胞21號染色體上的一個單核苷酸多態性位點，rs7844的檢測，進行了對唐氏綜合征進行快速產前診斷的研究。通過質譜SNP分型檢測，100例羊水標本中，只發現兩種rs7844等位基因型，分別是G/G及C/G，雜合度是26%，而沒有檢測到C/C的等位基因型，說明本地區rs7844的基因型分布可能有其自己的特征。然后在雜合子樣本可以滿足分析的情況下，進行了利用等位基因比率分析對唐氏綜合征進行產前診斷的研究。按照理論分析，一個二倍體雜合子胎兒，兩個等位基因的比率應該是1C︰1G；而一個21三體雜合子胎兒，兩個等位基因的比率應該是2C︰1G或1C︰2G。但是實際檢測中，根據質譜峰圖的直觀表現以及兩個等位基因的峰面積值，在21三體雜合子樣本中，只檢測出1C︰2G的等位基因型，而沒有檢測出2C︰1G的等位基因型。這也印證了在本地區G/G及C/G的基因型分布特征背景下，如果兩種基因型組合產生21三體，那么應該以1C∶2G的基因型為多數。通過等位基因比率分析，建立起二倍體樣本的參考區間，設定上限和下限，然后用每一個21三體樣本的比率值去和這個參考區間進行比較，發現所有的21三體樣本的比率值都位于這個參考區間最小值的下限外，從而使診斷的敏感性達到了100%。

檢測結果說明利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法產前檢測唐氏綜合征具有很高的準確性和靈敏度。而且該檢測方法不需羊水細胞體外培養，因而取樣時間不受孕周的限制；另外，從DNA提取到結果分析，在樣本量可以滿足分析的情況下，1～2個工作日即可完成。這恰恰補充了細胞核型分析的不足之處。

目前，用來快速產前檢測唐氏綜合征的方法有熒光定量聚合酶鏈反應(QF-PCR)[10]、多重連接探針擴增技術(MLPA)[11],以及基于高通量測序技術的非侵入性產前診斷[12]等。非侵入性產前診斷技術由于其檢測的樣本混有母血的成分，可靠性有待實踐的考證[13]，作為一種篩查方案應該更為適宜。而QF-PCR受限于特定的檢測人群。MLPA雖然可以覆蓋到所有人群，但是由于其檢測的是DNA樣本擴增后的總量，所以檢測結果可能會受到起始模板濃度的影響[14]。而本實驗中，由于檢測的是兩個等位基因量的比率值，而并不是DNA擴增后的總量，所以即使樣本的起始模板濃度參差不齊，也不會對實驗結果造成影響，從而保證了檢測結果的準確性。

由于本實驗的目的是探討利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法產前診斷唐氏綜合征的可行性，所以在實驗中只選取了一個SNP位點進行實驗研究，結果證明方案是可行的。當然，如果該檢測方法能夠應用到具體實踐中，僅僅依靠一個SNP位點是不夠的。在實驗中，利用一個SNP(rs7844)位點，唐氏綜合征樣本的檢出率達到了25%(6/24)。為了提高樣本的檢出率，就必須增加SNP雜合子的樣本數，這可以通過增加SNP位點來得到實現。理論上分析，選取5個雜合度在26%以上的SNP位點就可以達到約100%的樣本覆蓋率[1-(1-26%)5≈100%]。而時間飛行質譜技術高通量檢測的特性[15]，能夠一次完成對多個SNP的分型檢測[16]，可滿足對這一檢測的要求。當然，在實際檢測中，應該先對本地區21號染色體上的SNP進行雜合度的篩查，可以篩選出雜合度高的SNP，選取的數目應該盡量達到100%的人群覆蓋率，然后建立起每一個SNP的二倍體參考區間，這樣才能夠對待檢樣本進行唐氏綜合征的產前診斷。

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DNA-SNP allelic ratio analysis for rapid

diagnosis of prenatal Down syndrome

ZHANG Youcheng, ZHANG Zhijun, PAN Guozhen, LI Lan, FENG Yan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThePeople′sHospitalofGuizhouProvince,

Guiyang,Guizhou, 550002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of amniocyte DNA-SNP allelic ratio on rapid diagnosis of prenatal Down syndrome. Methods A total of 100 frozen amniotic fluid samples of singleton pregnancy were selected, including 24 cases of trisomy 21 and 76 cases of euploid by prenatal diagnosis. The heterozygosity of rs7844, a single-nucleotide polymorphism (SNP) located in chromosome 21, was detected by using matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer analysis, and the DNA-SNP allelic ratios of those cases with heterozygous SNPs were determined. Results26 cases with heterozygous SNP of rs7844 were found in 100 amniotic fluid samples, including 6 cases of trisomy 21 and 20 cases of euploid. The result of DNA-SNP allelic ratio for prenatal diagnosis of Down syndrome came out in 1 or 2 days, and its diagnostic sensitivity was 100%. ConclusionAmniocyte DNA-SNP allelic ratio analysis can be used for rapid prenatal diagnosis of Down syndrome.

KEYWORDS:amniocyte; single-nucleotide polymorphism; prenatal diagnosis; Down syndrome

基金項目:貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2013]2185號)

收稿日期:2014-12-06

中圖分類號:R 714.5

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-084-03

DOI:10.7619/jcmp.201509024