感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)腸道病毒的分子生物學(xué)分型研究

郭　華, 顏衛(wèi)紅, 李玉娟, 丁　惠

(山東省東營(yíng)市人民醫(yī)院, 1. 兒科; 2. 血液科; 3. 手術(shù)科, 山東 東營(yíng), 257000)

感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)腸道病毒的分子生物學(xué)分型研究

郭華1, 顏衛(wèi)紅1, 李玉娟2, 丁惠3

(山東省東營(yíng)市人民醫(yī)院, 1. 兒科; 2. 血液科; 3. 手術(shù)科, 山東 東營(yíng), 257000)

摘要:目的探討感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)腸道病毒(EV)的分子生物學(xué)分型。方法收集腦炎患兒腦脊液(CSF)樣本72例，以EV71、COXB3、ECHO30標(biāo)準(zhǔn)病毒株為陽(yáng)性對(duì)照，腦外科手術(shù)患兒CSF為陰性對(duì)照。采用通用引物和2種分型引物對(duì)CSF樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型研究。結(jié)果利用通用引物1次和2次PCR EV陽(yáng)性檢出率分別為69.44% (50/72)、73.61% (53/72), 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)VP1段進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 1次和2次PCR后，陽(yáng)性檢出率分別為26.42% (14/53)、62.26% (33/53)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 對(duì)VP2段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1次和2次PCR后，陽(yáng)性檢出率分別為16.98% (9/53)、54.72% (29/53), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 2種分型引物對(duì)EV RNA陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); EV陽(yáng)性樣本與EV標(biāo)準(zhǔn)毒株相關(guān)序列同源性均在97%以上。結(jié)論利用分型引物能夠檢測(cè)臨床常見EV的大多數(shù)血清型，可為防治EV引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供臨床參考。

關(guān)鍵詞:腸道病毒; 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng); 腦炎; 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染; 分子生物學(xué)分型

腸道病毒(EV)屬小RNA病毒科，因寄居于腸道而得名，有近70個(gè)血清型，包括柯薩奇病毒A1～23型、柯薩奇病毒B1～6型、埃可病毒1～31型、脊髓灰質(zhì)炎病毒1～3型及新型腸道病毒68～71型[1]。EV是引起人類感染的最常見病原體之一，各年齡階段均可發(fā)病，輕者為無(wú)癥狀感染，重者可引起腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、心肌炎、手足口病等疾病，甚至死亡[2-3]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和卡介苗的普遍接種，化膿菌和結(jié)核菌造成的腦膜炎、腦炎的發(fā)病率日趨降低，而病毒性腦膜炎、腦炎日益增多，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的最常見疾病[4]。本研究通過(guò)分子生物學(xué)中2次RT-PCR法，對(duì)EV感染陽(yáng)性者進(jìn)行分型研究，從而深入探尋EV的實(shí)驗(yàn)室及臨床檢測(cè)方法，為今后防治EV引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供理論基礎(chǔ)和臨床參考。

1資料與方法

1.1　一般資料

選擇2013年9月—2014年12月山東省立醫(yī)院集團(tuán)東營(yíng)醫(yī)院收治的病毒性腦炎患兒72例為研究對(duì)象，均根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、腦電圖等確診。其中男47例，女25例；年齡0.5～11歲，平均(5.39±2.11)歲；急性期38例，恢復(fù)期34例。另選同期行腦外科手術(shù)患兒17例作為陰性對(duì)照，均無(wú)臨床感染癥狀，血常規(guī)及生化指標(biāo)正常。其中男9例，女8例；年齡1～12歲，平均(5.61±1.97)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬知情同意。

1.2　方法

1.2.1樣本收集：腦炎患兒于入院當(dāng)天及恢復(fù)期分別抽取腦脊液(CSF)1.0 mL, 行細(xì)菌培養(yǎng)基常規(guī)檢查。選擇細(xì)菌培養(yǎng)陰性及糖、蛋白質(zhì)、氯化物等定量均正常的腦外科手術(shù)患兒CSF為陰性對(duì)照；采用EV71、COXB3、ECHO30標(biāo)準(zhǔn)病毒株為陽(yáng)性對(duì)照，以外科手術(shù)患兒CSF和磷酸鹽緩沖液稀釋。

1.2.2RNA提取及RT-PCR：采用改良的異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒RNA。提取完畢后立即常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照來(lái)確定反應(yīng)的正確性，所有PCR擴(kuò)增陰性或電泳條帶較弱的樣本，取擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR。2次PCR后，EV陽(yáng)性的CSF樣本利用分型引物分別對(duì)VP1段和VP2段進(jìn)行RT-PCR，PCR擴(kuò)增陰性或電泳條帶較弱的樣本，取擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR。

PCR引物序列(知行生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成)

通用引物15'-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3'25'-CACYGGATGGCCAATCCA-3'VP115'-MIGCIGYIGARACNGG-3'25'-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3'VP215'-GARGCITGYGGITAYAGYGA-3'25'-TTDATCCAYTGRTGIGG-3'

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加入1 μL loding buffer中，在含有1.5 μg/mL溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上，120 v電泳30 min后，置于波長(zhǎng)為300 nm紫外燈下觀察電泳條帶。

1.2.4EV型別確定：2種分型引物經(jīng)2次PCR均獲得陽(yáng)性結(jié)果的樣本中，隨機(jī)選出20例，回收純化產(chǎn)物，測(cè)定序列，測(cè)序結(jié)果采用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中EV標(biāo)準(zhǔn)毒株對(duì)比，進(jìn)行同源性分析。

1.3　觀察指標(biāo)

比較不同引物PCR檢測(cè)病毒性腦炎CSF樣本的結(jié)果；分析EV臨床毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中EV標(biāo)準(zhǔn)毒株的同源性。

2結(jié)果

2.1　通用引物RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

EV71、COXB3、ECHO30標(biāo)準(zhǔn)病毒株經(jīng)擴(kuò)增及電泳后，均顯示一條清晰的單克隆帶，約194 bp, 無(wú)非特異性擴(kuò)增；所有陰性對(duì)照樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均無(wú)明顯條帶；72例腦炎患兒CSF樣本1次PCR后，陽(yáng)性檢出率為69.44%(50/72), 剩余陰性樣本進(jìn)行2次PCR后，陽(yáng)性檢出率為13.64%(3/22), 即2次共檢出陽(yáng)性樣本53例(73.61%), 1次和2次PCR后EV RNA的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2。

注: 1為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物, 2～9為部分腦炎

注: 8為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物, 1～7為陰性

對(duì)照組樣本擴(kuò)增產(chǎn)物，M為Marker

圖2陰性對(duì)照組通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2　2種分型引物RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)VP1段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為357 bp的片段，1次PCR后陽(yáng)性檢出率為26.42%(14/53),2次PCR后陽(yáng)性檢出率為62.26%(33/53), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 對(duì)VP2段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為584 bp的片段，1次PCR后陽(yáng)性檢出率為16.98%(9/53)，2次PCR后陽(yáng)性檢出率為54.72%(29/53), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 2種分型引物對(duì)EV RNA陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、4。

注：1為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物，2～7為部分

注: 7為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物，1～6為

部分腦炎患兒樣本擴(kuò)增產(chǎn)物，M為Marker

圖4針對(duì)VP2段設(shè)計(jì)引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3　EV臨床毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中EV

標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性分析

20例陽(yáng)性樣本與EV標(biāo)準(zhǔn)毒株相關(guān)序列同源性均在97%以上。其中2例與ECHO30、1例與COXA11同源性高達(dá)99%; 2例與COXA9同源性為98%; 7例與COXB3、5例與ECHO12、2例與COXA7、1例與COXB5同源性均為97%。

3討論

EV為臨床常見病原體，但長(zhǎng)期以來(lái)病原診斷困難[5]。傳統(tǒng)EV診斷與定型方法為用敏感細(xì)胞培養(yǎng)病毒，然后用EV組合血清進(jìn)行型別鑒定。該法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，常出現(xiàn)無(wú)法定型的分離株[6]。其原因主要有: ① 20%以上血清型的EV，如柯薩奇病毒A組，難以在單層組織細(xì)胞中生長(zhǎng)[7]; ② 組合診斷血清并未包括所有血清型別，WHO推薦使用的RIVM診斷組合血清，只能鑒定出54.39%的型別[8]; ③ 2種及以上病毒混合感染或1種病毒聚集成團(tuán)，必須通過(guò)脫氧膽酸鈉或氯仿或超濾處理使其分散后才能定型; ④ 病毒抗原變異，出現(xiàn)新血清型。這些原因?qū)е旅庖邔W(xué)診斷敏感性低、特異性差，檢查結(jié)果不能及時(shí)指導(dǎo)急性期疾病的臨床診治。而腦組織活檢會(huì)侵害腦組織，嚴(yán)重地限制了其應(yīng)用。

近年來(lái)，RT-PCR已逐步應(yīng)用于多種疾病的病原學(xué)檢測(cè)中，在臨床檢測(cè)EV病原體方面同樣具有高敏感性、高特異性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9]，能使低豐度的mRNA被擴(kuò)增放大易于檢測(cè)[10]。Piralla等[11]采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)呼吸道EV-D68，Pabbaraju等[12]利用多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)不同型別的EV，均獲得較高的靈敏度和特異性。

本研究采用RT-PCR方法，以通用引物對(duì)3株陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)毒株、72例腦炎臨床標(biāo)本及陰性對(duì)照組進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)毒株經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物均顯示一條長(zhǎng)度約為194 bp的單克隆帶，條帶清晰、無(wú)非特異性擴(kuò)增；所有陰性對(duì)照樣本均不能被擴(kuò)增檢測(cè)。表明以通用引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、可靠性高。在72例臨床診斷為腦炎的CSF樣本中EV陽(yáng)性檢出率為73.61%, 與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究基本一致[13-15], 表明在腦炎患兒中，EV仍是占第一位的病原體。隨機(jī)抽取的20例陽(yáng)性樣本全部成功分型，表明通用引物與分型引物檢測(cè)的特異性高，提示應(yīng)用分型引物結(jié)合EV標(biāo)準(zhǔn)毒株序列比較，能夠克服傳統(tǒng)血清學(xué)分型的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步治療提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

[1]何麗蕓, 何雅青, 張利平, 等. 腸道病毒核酸快速定量檢測(cè)方法建立[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2010, 26(3): 383.

[2]Giulieri S G, Chapuis-Taillard C, Manuel O, et al. Rapid detection of enterovirus in cerebrospinal fluid by a fully-automated PCR assay is associated with improved management of aseptic meningitis in adult patients[J]. J Clin Virol, 2015, 62: 58.

[3]Hwang S, Kang B, Hong J, et al. Development of duplex real-time RT-PCR based on Taqman technology for detecting simultaneously the genome of pan-enterovirus and enterovirus 71[J]. J Med Virol, 2013, 85(7): 1274.

[4]Akhvlediani T, Bautista CT, Shakarishvili R, et al. Etiologic agents of central nervous system infections among febrile hospitalized patients in the country of Georgia[J]. PLoS One, 2014, 9(11): e111393.

[5]龐靖祥. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病重要病原體寡核苷酸檢測(cè)芯片的初步研究[D]. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2008.

[6]楊秀惠, 何家鑫, 嚴(yán)延生, 等. 一起手足口病暴發(fā)的病原學(xué)診斷與分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2007, 23(4): 323.

[7]劉尚允, 王麗春, 董承紅, 等. 柯薩奇病毒A組16型G20分離株在不同培養(yǎng)條件下的增殖動(dòng)力學(xué)[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2012, 25(8): 963.

[8]楊秀惠. 腸道病毒遺傳性分析及早期實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究[D]. 福建醫(yī)科大學(xué), 2005.

[9]李虹澤, 項(xiàng)杰. 武漢地區(qū)2011年553例手足口病患兒EV71-IgM ELISA法和EV71 RNA RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果分析[J]. 臨床肺科雜志, 2012, 17(9): 1726.

[10]Ding X, Nie K, Shi L, et al. Improved detection limit in rapid detection of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by a novel reverse transcription-isothermal multiple-self-matching-initiated amplification assay[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(6): 1862.

[11]Piralla A, Girello A, Premoli M, et al. A new Real-Time RT-PCR Assay for Detection of Human Enterovirus 68(EV-D68) in Respiratory Samples[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(4): 03691.

[12]Pabbaraju K, Wong S, Wong AA, et al. Detection of enteroviruses and parechoviruses by a multiplex real-time RT-PCR assay[J]. Mol Cell Probes, 2015, 29(2): 81.

[13]Tsai JD, Tsai HJ, Lin TH, et al. Comparison of the detection rates of RT-PCR and virus culture using a combination of specimens from multiple sites for enterovirus-associated encephalomyelitis during enterovirus 71 epidemic[J]. Jpn J Infect Dis, 2014, 67(5): 333.

[14]鄭煥英, 李暉, 曾漢日, 等. 一起腸道病毒腦炎的病原學(xué)快速檢測(cè)分析[J]. 中國(guó)病毒病雜志, 2013, 3(1): 37.

Study on molecular biological types of enterovirus

infecting central nervous system

GUO Hua1, YAN Weihong1, LI Yujuan2, DING Hui3

(1.DepartmentofPediatrics; 2.DepartmentofHematology; 3.DepartmentofSurgery,

People′sHospitalofDongying,Dongying,Shandong, 257000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the molecular biological types of enterovirus (EV) that could infect central nervous system (CNS). MethodsA total of 72 samples of cerebrospinal fluid (CSF) from children with encephalitis were collected, with standard viral strain EV71, COXB3 and ECHO30 as positive control and CAF from children underment brain surgery as negative control. The CSF samples were expanded by using common primers and 2 type primers so as to conduct type research on the expanded products. ResultsThe positive detection rates once and twice after the application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) with common primers were 69.44% (50/72) and 73.61% (53/72), respectively, but the difference was not significant (P>0.05). PCR expansion was conducted to VP1 segment, and the positive detection rates once and twice after the application of PCR with common primers were 26.42% (14/53) and 62.26% (33/53), respectively (P<0.01), which were 16.98%(9/53) and 54.72%(29/53) after the PCR expansion to VP2 segment (P<0.01). Moreover, there was no significant difference between the two primers in detecting EV (P>0.05). The homology of relevant sequences in VE positive samples and EV standard viral strains was more than 97%. ConclusionThe application of type primers can detect the most serum types of EV, thus providing clinical reference for the prevention of EV-induced CNS infection.

KEYWORDS:enterovirus; reverse transcriptase polymerase chain reaction; encephalitis; central nervous system; molecular biological type

基金項(xiàng)目:中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11520926)

收稿日期:2015-01-20

中圖分類號(hào):R 373.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-097-04

DOI:10.7619/jcmp.201509028