漢黃芩素對胃癌細胞分泌TGF-β1及誘導Treg細胞的影響

張艷青, 龐　磊, 吳克艷, 梁　鈺, 肖煒明, 鄧　彬

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 揚州大學附屬第二臨床醫學院 消化內科, 江蘇 揚州, 225001)

漢黃芩素對胃癌細胞分泌TGF-β1及誘導Treg細胞的影響

張艷青1, 龐磊1, 吳克艷2, 梁鈺2, 肖煒明2, 鄧彬2

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 揚州大學附屬第二臨床醫學院 消化內科, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的觀察漢黃芩素對胃癌細胞分泌TGF-β1的影響，明確漢黃芩素是否可抑制幼稚T細胞向Treg細胞的轉化。方法分別在缺氧及常氧條件下培養胃癌細胞株AGS、BGC823，并在其培養體系中加入漢黃芩素。以ELISA法檢測胃癌細胞培養上清中TGF-β1的濃度。以胃癌細胞培養上清制備條件培養基，分別培養磁珠分選的CD4+CD25-T細胞72 h, 流式檢測Foxp3+Treg細胞的比例。結果常氧條件下，漢黃芩素對AGS細胞分泌TGF-β1無明顯抑制作用，而對BGC823細胞分泌TGF-β1有抑制作用；缺氧條件下，漢黃芩素對AGS細胞和BGC823分泌TGF-β1均有抑制作用。以常氧培養的AGS細胞培養上清為條件培養基，漢黃芩素組與溶媒組CD4+Foxp3+T細胞比例無明顯差異；以缺氧培養的AGS細胞培養上清為條件培養基，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細胞比例明顯降低。結論漢黃芩素可抑制缺氧導致的胃癌細胞TGF-β1高表達，并可抑制其誘導Treg細胞的能力。

關鍵詞:漢黃芩素; 胃癌細胞; TGF-β1; Treg細胞; 影響

漢黃芩素(wogonin)是半枝蓮的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗炎、鎮靜和廣泛的抗腫瘤活性等作用。本課題組前期研究發現,漢黃芩素不僅具有直接的抗腫瘤作用，而且可通過影響DC、T、NK等免疫細胞活性，發揮其誘導腫瘤細胞免疫原性死亡作用。本研究首先以漢黃芩素處理胃癌細胞，觀察其對TGF-β1表達的影響，并以漢黃芩素處理的胃癌培養上清培養T細胞，觀察其對誘導Treg細胞生成的影響。

1材料與方法

1.1　試劑、細胞系及儀器設備

健康個體的外周靜脈肝素抗凝血由揚州市血站提供；人胃癌細胞株AGS、 BGC823由上海交通大學附屬瑞金醫院消化病研究所惠贈；漢黃芩素(純度>98%)購自南京澤朗有限公司；Recombinant humanTGF-β1、recombinant mouse IL-2(R&D，美國)；抗人CD3/CD28抗體包被磁珠、(Invitrogen，美國)；人CD4+CD25+Treg細胞分選磁珠(Miltenyi，德國); MACS分選器、分選架、MS分選柱及LD分選柱(Miltenyi，德國)；人TGF-β1ELISA檢測試劑盒(eBioscience,美國)；人調節性T淋巴細胞流式檢測試劑盒(Ebioscience，美國)；三氣培養箱(Ruskinn Works，英國)；細胞培養箱(Thermo，美國)

1.2　實驗方法

PBMC分離、流式細胞儀檢測、ELISA檢測TGF-β1、磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細胞等實驗方法同第3部分。

1.2.1胃癌細胞培養及條件培養基制備:取AGS及BGC823細胞單細胞懸液，以每孔3×105個/mL接種于6孔培養板(每孔1 mL); 待細胞貼壁后，倒棄培養基，溶媒組加入1.5 mL含終濃度為0.4 mM NaOH的AIMV無血清培養基，漢黃芩素干預組調整藥物終濃度為20 μg/mL, 另設陰性對照組(不加藥物及溶媒)。各組細胞分別于37 ℃, 常氧(21% O2, 5% CO2, 74% N2)及乏氧(1% O2, 5% CO2，74% N2)條件下誘導培養。24 h后收集細胞上清液，0.4 μm過濾。Control培養基制備: AIMV無血清培養基、30 U/mL recombinant IL-2。Normoxic培養基制備: 21% O2條件下AGS細胞培養上清(包括溶媒組、漢黃芩素組及AIMV組)+新鮮AIMV培養基(1∶2混合)、30 U/mL recombinant IL-2。Hypoxic組培養基制備: 1% O2條件下AGS細胞培養上清(包括溶媒組、漢黃芩素組及AIMV組)+新鮮AIMV培養基(1∶2混合)、30 U/mL recombinant IL-2。

1.2.2磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細胞：密度梯度離心法分離人外周血單核細胞(PBMC), 以1640培養基混勻，計數細胞，標記磁珠抗體，以磁珠分選器陰性選擇分離CD4+CD25-T細胞，收集。

1.2.3ELISA檢測細胞培養上清TGF-β1含量：采集細胞培養上清1∶50用PBS稀釋后，每100 μL樣品加入20 μL 1NHCl酸化樣品，5 min后加入20 μL NNaOH中和。稀釋標準品，100 μL/孔加入相應的孔中，每個濃度標準品設兩個復孔。稀釋后的細胞上清按100 μL/孔加入相應孔中，每個樣品設兩個復孔。密封后置于搖床上孵育2 h。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板5次，每次1 min。稀釋檢測抗體, 100 μL/孔加入相應的孔中，密封后置于搖床上孵育1 h。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板5次，每次1 min。Avidin-HRP, 100 μL/孔加入相應的孔中，密封后置于搖床上孵育30 min。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板7次，每次1 min。96孔板中加入100 μL/孔Substrate Solution, 室溫下孵育15 min。96孔板中加入50 μL/孔終止液。酶標儀讀板。

1.3　漢黃芩素對誘導Treg細胞生成的影響

磁珠分選得來的CD4+CD25-T細胞分別以Control培養基、Normoxic培養基、Normoxic+ wogonin培養基、Normoxic+ solvent培養基、Hypoxic培養基、Hypoxic+ wogonin培養基、Hypoxic+ solvent培養基重懸，調整濃度為1×106個細胞/mL，取800 μL加入48孔板；按細胞:磁珠(5∶1)比例加入抗人CD3/CD28抗體包被的磁珠，37 ℃ 5% CO2孵育72 h。采集細胞, PBS沖洗, 300 g/min離心10 min, 孵育熒光抗體上機流式檢測。

1.4　統計學方法

本實驗采用SPSS 17.0統計軟件對結果進行分析。所有實驗結果以均數±標準差來表示。Students′t檢驗對組間差異進行比較。以檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1　漢黃芩素抑制胃癌細胞分泌TGF-β1

為了證實漢黃芩素是否影響胃癌細胞分泌TGF-β1，在AGS及BGC823細胞的培養體系中，分別加入漢黃芩素(20 μg/mL)孵育24 h，用ELISA方法檢測細胞上清中TGF-β1。結果顯示，常氧條件下漢黃芩素組與溶媒組AGS細胞分泌TGF-β1水平無明顯差異(P<0.05)，漢黃芩素組BGC823細胞分泌TGF-β1水平較溶媒組降低(P<0.05); 缺氧條件下漢黃芩素組AGS細胞和BGC823細胞分泌TGF-β1水平均較溶媒組降低(P<0.01)。提示漢黃芩素可抑制胃癌細胞分泌TGF-β1，而在缺氧條件下這種抑制作用更為明顯。見圖1。

A.常氧條件下漢黃芩素對AGS細胞分泌TGF-β1無明顯抑制作用(#P<0.05),缺氧條件下漢黃芩素可抑制AGS細胞分泌TGF-β1(**P<0.01)B.常氧條件下漢黃芩素可抑制BGC823細胞分泌TGF-β1(*P<0.05),缺氧條件下漢黃芩素可抑制BGC823細胞分泌TGF-β1(**P<0.01)圖1 漢黃芩素抑制胃癌AGS和BGC823細胞TGF-β1分泌

2.2漢黃芩素抑制胃癌細胞培養上清誘導Treg細胞的能力

為了驗證漢黃芩素是否對胃癌細胞培養上清誘導Treg細胞有影響，作者以AGS的細胞培養上清作為條件培養基，用以培養磁珠分選得來的CD4+CD25-T細胞72 h, 流式檢測CD4+Foxp3+T細胞細胞比例。結果發現：常氧培養的AGS上清，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細胞比例無明顯差異(P<0.05); 而缺氧培養的AGS上清，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細胞比例降低(P<0.01)。提示漢黃芩素可抑制胃癌細胞上清誘導Treg細胞的能力。見圖2。

A.流式細胞儀檢測的代表性結果B.不同統計學分析結果,*P<0.05;**P<0.01圖2 漢黃芩素抑制AGS培養上清誘導Treg細胞

3討論

半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don.)別名并頭草、狹葉寒信草，為管狀花目、唇形科、黃芩屬植物，分布于阿根廷、巴西南部、烏拉圭以及中國浙江、福建、江蘇等地。全草入藥，味辛微苦，性寒，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫等功效。目前已經從半枝蓮中分離了生物堿和黃酮類等化合物，其中漢黃芩素是半枝蓮的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等作用[1]。

以往研究[2-3]發現漢黃芩素可從腫瘤的血管生成、腫瘤細胞增殖[4-5]、凋亡[6-8]、遷移[9-10]等方面發揮抗腫瘤作用。本課題組前期動物實驗研究發現半枝蓮提取物可通過下調VEGF和上調DC發揮免疫調控作用，進而抗腫瘤[11]。通過體外細胞實驗[12]發現，漢黃芩素可升高胃癌細胞SGC-7901的ROS水平激活Caspase-3，進而誘導SGC-7901細胞凋亡。Dandawate S等[13]最近報道通過細胞模型及動物實驗的研究發現漢黃芩素可抑制神經膠質細胞瘤分泌TGF-β1, 并進一步阻斷TGF-β1誘導Treg細胞的作用，提示漢黃芩素可通過靶向Treg細胞發揮抗腫瘤效應。Song X等[14]的研究則發現漢黃芩素可通過羥基化途徑促進腫瘤細胞中HIF-1α降解，降低腫瘤細胞分泌VEGF的水平，抑制腫瘤血管生成，提示漢黃芩素或可影響缺氧相關的分子通路發揮抗腫瘤效應。本研究的前三部分內容證實缺氧可促進胃癌細胞分泌TGF-β1, 后者誘導Treg細胞生成，進而抑制抗腫瘤免疫效應，而漢黃芩素的抗腫瘤機制是否涉及此級聯反應，目前尚未見報道，本部分研究在此方面做了初步探索。

本研究中經漢黃芩素處理的胃癌細胞AGS和BGC823，分別在常氧和缺氧條件下培養，結果發現漢黃芩素可抑制胃癌細胞分泌TGF-β1的能力，而缺氧條件下這種抑制能力更為顯著，結合以往文獻報道，作者推測漢黃芩素可能通過阻斷缺氧相關的分子通路而抑制TGF-β1的表達。本研究進一步以漢黃芩素處理的胃癌細胞培養上清培養CD4+CD25-T細胞，繼而以流式技術檢測Treg細胞比例，作者發現對于常氧條件下培養的胃癌細胞，漢黃芩素處理與否對其誘導Treg細胞的能力并沒有明顯影響，而對于缺氧培養的胃癌細胞，漢黃芩素可明顯降低其誘導Treg細胞的能力。結合以往研究，作者推測漢黃芩素可通過下調缺氧條件下胃癌細胞TGF-β1的分泌水平，抑制其誘導Treg細胞生成的能力，此機制可能為漢黃芩素抗腫瘤效應的重要組成部分。

綜上所述，初步的研究結果證實漢黃芩素可抑制缺氧導致的胃癌細胞分泌TGF-β1，并可部分阻斷其對Treg細胞的誘導作用。而體內漢黃芩素是否影響腫瘤缺氧相關的分子通路及機體的免疫調控，尚不得而知。因而，尚需要設計更為嚴謹的實驗來驗證漢黃芩素是否通過調控機體免疫來發揮抗腫瘤效應，以期為其用于臨床腫瘤治療提供依據。

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Influence of wogonin on TGF-β1secretion of gastric cancer cells and induction of Tregs

ZHANG Yanqing1, PANG Lei1, WU Keyan2, LIANG Yu2,

XIAO Weiming2, DENG Bin2

(1.MedicalCollegeofYangzhouUniversity，Yangzhou,Jiangsu, 225001;

2.DepartmentofGastroenterology,ThesecondClinicalSchoolofYangzhouUniversity,

Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe influence of wogonin on TGF-β1secretion of gastric cancer cells and to verify whether wogonin inhibits the ability of inducing CD4+Foxp3+T cells via TGF-β1.Methods Human gastric cancer cell lines, AGS and BGC823 were cultured in 5% CO2at 37 ℃ for 24 hours under hypoxic (1.0% O2) or normoxic (21% O2) conditions. Wogoins were added into AGS and BGC823 cell culture system for 24 hours. TGF-β1concentration in culture supernatants were detected by ELISA. The supernatants collected from cultured AGS and BGC823 cells were made into condition medium to culture isolated CD4+CD25-T cells. Flow cytometry were used to detect the Foxp3+Tregs.ResultsUnder normoxic conditions, Wogonin affected TGF-β1secretion of AGS cells, but inhibited TGF-β1secretion of BGC823 cells. Under hypoxic conditions,wogonin inhibited TGF-β1secretion both of BGC823 cells and AGS cells. Cultured in normoxic condition meidiums, there were no significant difference of CD4+Foxp3+T cells proportion between wogonin and solvent groups. Cultured in hypoxic condition meidiums, the proportion of CD4+Foxp3+T cells in wogonin groups was lower than that in solvent groups. ConclusionWogonin can not only suppress TGF-β1expression caused by hypoxia in gastric cancer cells, but also inhabit the induction of Tregs.

KEYWORDS:wogonin; gastric cancer cells; TGF-β1; Treg cells; influence

基金項目:江蘇省高校自然科學研究面上項目(12KJD320007)

收稿日期:2015-06-28

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)21-020-04DOI: 10.7619/jcmp.201521006