稀堿-Fenton試劑預處理對云南苦竹酶水解得率的影響

王燕云， 楊 靜

(1.西南林業大學 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室,云南 昆明 650224;2.西南林業大學 材料工程學院，云南 昆明 650224)

·研究報告——生物質化學品·

稀堿-Fenton試劑預處理對云南苦竹酶水解得率的影響

王燕云1,2， 楊 靜

(1.西南林業大學 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室,云南 昆明 650224;2.西南林業大學 材料工程學院，云南 昆明 650224)

利用響應面法對稀堿-Fenton反應預處理竹粉的條件進行優化，確定最佳的Fenton預處理條件為：1 g 稀堿預處理后竹粉底物加入質量分數30 %的 H2O2溶液3.4 mL，Fe2+濃度15.8 mmol/L，反應時間12 h，獲得的 72 h 酶水解得率為49.98%。與原料和經2%NaOH 預處理后的樣品相比，經2%NaOH-Fenton 預處理后的樣品中纖維素含量升高，半纖維素和木質素含量降低，72 h酶水解得率為48.24%，分別提高了47.79和37.44個百分點。當纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g(以纖維素質量計)時，72 h 酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率提高了22.80%。

響應面法；Fenton反應；酶水解得率

纖維素乙醇作為一種可再生的能源，其經濟前景和環境效益越來越受重視[1]。纖維素乙醇的制備主要經過原料預處理、纖維素酶水解、糖液(戊糖、己糖)乙醇發酵和酒精蒸餾脫水等過程[2]。盡管木質纖維生物質是地球上最多的碳水化合物，來源廣泛、價格低廉，但其利用也面臨很多挑戰，如木質纖維生物質的結構復雜、糖苷鍵對纖維素酶的不可及度低、處理過程中可溶性抑制物的形成、混合糖的發酵效率低等均使得原料預處理成為限制木質纖維素利用的瓶頸。木質纖維原料預處理的主要目的是破壞木質纖維的超分子結構，使原料中纖維素、半纖維素和木質素實現分離，提高纖維素酶對纖維素的可及度，從而提高纖維素的酶水解性能[3]。研究證實預處理過程的費用占總成本的20%左右[4-5]，因此開發一種高效率、低能耗、低成本的預處理方法是當前的研究熱點。H2O2與Fe2+催化劑構成的氧化體系稱為Fenton試劑，其發生的氧化反應稱為Fenton反應(H2O2+Fe2+→H2O+Fe3++·OH)。其本質是在Fe2+離子的催化作用下H2O2的分解活化能低(34 kJ/mol)，能夠產生大量的中間產物羥基自由基(·OH)，并依靠羥基自由基氧化分解有機物。本研究擬建立一種稀堿-Fenton試劑預處理竹粉的兩段預處理方法，NaOH能使纖維素潤脹，利于木質素的溶出；而Fenton反應產生的·OH使底物中纖維素結構疏松和纖維素三維結構發生變化，最終達到提高后續酶水解效率的目的。

1 實 驗

1.1 材料

云南苦竹(Pleioblastusamarus(Keng)Keng f.)的竹片殘渣來自云南省云景林紙股份有限公司，經粉碎，過篩孔直徑0.30～0.45 mm得到竹粉，其化學組成為：纖維素41.23%、木聚糖22.30%、酸溶木質素1.36%、酸不溶木質素29.83%、 灰分3.03%。

H2O2(質量分數≥30%)，七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，為淡藍綠色結晶。所用試劑均為分析純。

里氏木霉纖維素酶和β-葡萄糖苷酶均由丹麥諾維信(Novozyme)公司生產，Sigma 公司提供。里氏木霉纖維素酶的濾紙酶活125 FPIU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活330 IU/mL。

1.2 稀堿預處理

將竹粉在20 g/L的NaOH 溶液、固液比1∶10(g∶mL，下同)和65 ℃下處理2 h。反應結束，用蒸餾水洗滌固體殘渣，作為Fenton反應的底物。

1.3 Fenton反應預處理

取稀堿預處理后的竹粉1 g，加入質量分數30% H2O22～4 mL，調節Fe2+濃度5.79～15.79 mmol/L，固液比1∶10，并于pH值3.0和16.76 r/s 的條件下反應12～36 h。反應結束后，用蒸餾水洗滌固體渣，作為纖維素酶水解反應的底物。

1.4 酶水解方法

取絕干質量為10 g的預處理料置于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使底物質量分數為10%，溶液pH值為4.8，酶用量為15 FPIU/g(以纖維素質量計，下同)。充分攪拌均勻后，置于50 ℃、150 r/min的搖床中反應。分別于2、4、8、12、24、48、72 h取樣，于3 000 r/min下離心10 min，取上清液適當稀釋后用高效液相色譜(HPLC)測定反應液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計算纖維素酶水解得率[6-7]。纖維素水解得率(Y)可用下式計算：

Y=(c×V×0.9)/(m×w)×100%

式中：Y—纖維素水解得率，%； c—水解液中葡萄糖和纖維二糖質量濃度，g/L；V—水解液體積，L； 0.9—纖維素和葡萄糖之間的轉換系數；m—原料質量，g；w—原料中纖維素的質量分數，%。

1.5 響應面分析方法

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理[8]，綜合前期試驗結果，選取Fe2+濃度、30%H2O2用量、反應時間，采用3因素3水平的響應面分析方法進行試驗條件優化，采用Design-Expert, Version 7.0軟件進行試驗設計與數據分析。

1.6 分析方法

1.6.1 水分含量的測定 水分含量的測定采用紅外線水分計FD-720測定。

1.6.2 纖維素、半纖維素和木質素的測定 樣品的纖維素、半纖維素和木質素的組成按美國可再生能源實驗室公布的方法測定[9]。

1.6.3 酶水解液中糖組分的測定 采用高效液相色譜(HPLC, Agilent technology 1100 series, Palo Alto, CA)法測定酶水解液中的糖組分。酶水解后的上清液經0.45 μm 濾膜過濾后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L 的硫酸作為流動相，流速為0.6 mL/min，在示差折光檢測器(RI)上進行檢測。

2 結果與分析

2.1 響應面優化試驗及結果分析

綜合前期試驗的結果，運用Design-Expert 7.0 軟件，根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，以酶水解得率為響應值，選擇30% H2O2用量(X1)、Fe2+濃度(X2)和反應時間(X3)為變量，進行3因素3水平響應面試驗，試驗設計及結果如表1 所示。

表1 響應面試驗設計及結果

響應面設計共有17 個試驗點，其中12 個為分析因子，5 個為零點，零點試驗用作誤差估計。對表1試驗得到的響應值進行多元回歸擬合，得到以酶水解得率為目標函數的二次多元回歸方程：Y=48.22+1.58X1+1.62X2+0.66X3+0.20X1X2+0.23X1X3-1.23X2X3-1.17X12-0.92X22+0.52X32回歸方程中，各項系數的絕對值大小反映了各因素對酶水解得率的影響程度。由該方程可知，對酶水解得率的影響順序由大到小為：Fe2+濃度、H2O2用量、反應時間。對上述回歸模型進行方差分析以檢驗方程的有效性，方差分析結果見表2。

表2 回歸模型方差分析

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著程度由F檢驗判定，模型P值小于0.000 1，遠遠小于0.050 0，表明該模型具有較高的顯著水平；且相關系數R2=97.96%，說明響應值的變化有97.96%來源于所選3個變量，即30% H2O2用量，Fe2+濃度和反應時間。失擬差項P值為0.055 7且大于0.050 0,表明失擬差項不顯著，試驗模型的失擬度好。可以用該模型對實驗結果進行預測和分析。

對因素X1、X2、X3及其交互項X1X2、X1X3、X2X3進行分析，一次項X1、X2和X3的P值均小于0.050 0，表明質量分數30%的H2O2，Fe2+濃度和反應時間這3個變量對酶水解得率的影響都具有較高的顯著性；二次項X12，X22，X32的P值也都小于0.050 0，說明質量分數30%的H2O2，Fe2+濃度和反應時間都具有較高的顯著性，對響應值的影響相對復雜，具有顯著的曲面效應；交互項X2X3的P值小于0.050 0，說明Fe2+濃度和反應時間的交互影響顯著。

利用模型確定最佳的酶水解條件為30% H2O23.36 mL，Fe2+濃度15.79 mmol/L，反應時間12 h，預測在該條件處理下的酶水解得率為50.53%。圖1是各個變量相互之間的響應面曲線圖，每個圖表示的是當一個變量為編碼零水平時其他兩個變量的相互作用對響應值的影響[10]。

圖1 響應曲面圖

由圖1可以看出質量分數30%的H2O2用量、Fe2+濃度和反應時間這3個變量對酶水解得率的影響程度。在圖1(a) 中，Fe2+濃度對酶水解得率的影響程度大于質量分數30%的H2O2；圖1(b)顯示Fe2+濃度對酶水解得率的影響程度大于反應時間；圖1(c) 可以看出，質量分數30%的H2O2對酶水解得率的影響程度大于反應時間。由此可知，各因素對酶水解得率的影響程度為：Fe2+濃度>H2O2用量>反應時間。

2.2 驗證實驗

為檢驗響應面結果的有效性，在1 g預處理后竹粉中加入質量分數30%的H2O2溶液3.4 mL，Fe2+濃度15.8 mmol/L，反應時間12 h的條件下進行了3組平行的驗證試驗，酶水解得率分別為49.35%、49.87%和50.73%,平均值為49.98%。實驗說明該回歸方程與實際實驗有較好的擬合度，證明響應面優化法得到的最佳參數是合理的。

2.3 NaOH-Fenton預處理對化學組分及酶水解得率的影響

為了解兩段預處理方法對樣品化學組成的影響，分別測定了3種樣品的化學組成；并且在底物質量分數10%，pH值4.8,50℃，攪拌速度150 r/min，纖維素酶用量15 FPIU/g的條件下水解72 h，結果如表3所示。

表3 3種樣品的化學組成和酶水解得率

木質纖維原料中纖維素、半纖維素和木質素之間形成的致密結構不利于纖維素酶與纖維素的接觸，因此木質纖維原料在纖維素酶水解前必須經過預處理。稀堿預處理有利于斷裂木質素、纖維素和半纖維素之間的酯鍵連接，溶出木質素，同時對纖維素進行潤脹，降低纖維素的結晶度，從而提高原料中纖維素酶對纖維素的可及度，促進后續的酶水解作用。Fenton反應產生的·OH具有較強的氧化性，可奪取葡萄糖單體上的羥基的電子，使其氧化為醛基，從而使底物中纖維素和半纖維素結構疏松，最終達到提高后續酶水解效率的目的。由表3可知，與原料相比，經2% NaOH 預處理后的樣品中木質素含量降低，纖維素含量升高，72 h酶水解得率10.80%比原料的0.45%提高了10.35個百分點。經2% NaOH-Fenton 預處理后的樣品中半纖維素含量比原料和經2% NaOH 預處理后的樣品中減少了50%左右，纖維素含量增加。72 h酶水解得率為48.24%，分別比原料和經2% NaOH 預處理后的酶水解得率提高了47.79和37.44個百分點。由此可知，把稀堿-Fenton反應用于原料的預處理可以明顯破壞木質纖維原料的結構，降低木質素和半纖維素的含量，提高纖維素與纖維素酶之間的接觸，從而提高酶水解得率。

2.4 酶用量對酶水解得率的影響

在底物質量分數10%，pH值4.8,50 ℃，攪拌速度150 r/min，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量比為2∶1，最大纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g，并且在響應面優化得出的最佳Fenton條件下，稀堿-Fenton試劑預處理后的竹粉水解72 h，結果如表4 所示。

表4 酶用量對酶水解得率的影響

由表4 可知，酶水解得率隨著纖維素酶用量的增加而增加，但當酶用量達到一定值后，酶水解得率增加幅度變小，當纖維素酶用量為20 FPIU/g時，72 h的水解得率為55.86%。纖維素酶為一復合酶系，主要由內切型(β-1，4)葡聚糖酶、外切型(β-1，4)葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成[11]。在纖維素酶水解纖維素的過程中，內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶受不斷增加的纖維二糖抑制，而β-葡萄糖苷酶對葡萄糖的累積更敏感，但對于整個纖維素酶系來說，纖維二糖的抑制作用強于葡萄糖。里氏木霉是目前公認的最有工業應用前景的可用于木質纖維原料糖化的纖維素酶生產菌株，而里氏木霉自身β-葡萄糖苷酶分泌量的不足可通過外源添加β-葡萄糖苷酶的輔助方式實現對纖維素的高效水解。在一定的范圍內，糖化率隨著體系中β-葡萄糖苷酶活力的增加而增加，當β-葡萄糖苷酶活力增加到一定程度后，糖化程度就基本趨于恒定。采用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量比2∶1，從表4 可看出，添加外源β-葡萄糖苷酶后，纖維素酶水解得率均有大幅度的提高，當纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g時，酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率62.41%提高了22.80%。添加外源的β-葡萄糖苷酶后，商品酶和自產酶的酶系結構趨于合理，β-葡萄糖苷酶與內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的協同作用較好，纖維素酶的整體水解效率提高。

3 結 論

3.1 利用響應面法優化稀堿-Fenton試劑預處理竹粉的條件，得到最佳的Fenton預處理條件為： 1 g稀堿預處理后竹粉底物加入質量分數30%的H2O2溶液3.4 mL， Fe2+濃度15.8 mmol/L，反應時間12 h，獲得的酶水解得率為49.98%。

3.2 與原料和經2% NaOH 預處理后的樣品相比，經2% NaOH-Fenton 預處理后的樣品中纖維素含量升高，半纖維素和木質素含量降低，72 h酶水解得率為48.24%，分別提高了47.79和37.44個百分點。

3.3 當纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g(以纖維素質量計)時，72 h酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率提高了22.80%。

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Influence of Alkaline-Fenton Pretreatment on the EnzymaticHydrolysis Yield of Yunnan Bamboo

WANG Yan-yun1,2, YANG Jing1,2

(1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Wood Adhesives and Glued Products,Southwest Forestry University， Kunming 650224,China； 2.College of Materials Science and Engineering,Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The optimum reaction conditions of alkaline-Fenton pretreatment of bamboo were obtained through the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions of Fenton reaction were alkaline treated bamboo 1 g, 30% H2O23.4 mL, concentration of Fe2+15.8 mmol/L, and reaction time 12 h. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 49.98%. The sample pretreated by 2% NaOH-Fenton had higher cellulose content and lower hemicellulose and lignin content compared with the materials and sample pretreated by 2% NaOH. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 48.24% and increased by 47.79% and 37.44%, respectively. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 76.64% when the dosage of the cellulase and theβ-glucosidase were 32 FPIU/g and 16 IU/g, respectively. This was 22.80% higher than that with the single use of the cellulase 32 FPIU/g.

response surface methodology; Fenton reaction; enzymatic hydrolysis yield

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.004

2015- 05- 25

國家自然科學基金資助項目(31260162)

王燕云(1991—),女，江蘇蘇州人，碩士生，研究方向為生物質能源

*通訊作者：楊 靜(1976—)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事木質纖維素的生物降解與轉化的研究；E-mail:kmjingyang@163.com 。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0017- 06