熒光原位雜交技術在尿路上皮腫瘤診斷中的臨床應用*

周怡 方強 陳志文 季惠翔 潘進洪

(第三軍醫大學西南醫院·全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

熒光原位雜交技術在尿路上皮腫瘤診斷中的臨床應用*

周怡 方強 陳志文 季惠翔 潘進洪

(第三軍醫大學西南醫院·全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

目的 探討通過熒光原位雜交檢測3、7和17號染色體及p16位點異常在預測尿路上皮腫瘤的臨床應用價值。方法 收集尿路上皮腫瘤患者和健康成人作正常對照組尿液，同時行尿脫落細胞學及FISH檢測3、7、17號染色體及p16位點異常。采用正常對照組各染色體異常數據設定閾值用于腫瘤患者的實驗室診斷。分別計算FISH和尿脫落細胞對尿路上皮腫瘤診斷的敏感度和特異度。分析各染色體畸變與尿路上皮腫瘤病理分級的關系。結果 ①尿脫落細胞學檢查的腫瘤陽性檢出率為11.5%，FISH為97.1%，兩者差異有統計學意義(P<0.01) ②各染色體及區帶均呈現較高的畸變發生率，其中多體畸變發生率由高到低依次為82.6%(7號)、71.7%(17號)、 66.6%(3號)和49.2%( p16位點)，單體畸變發生率由高到低依次為53.6%(p16位點)、 36.9%(7號)、34.7%(3號) 和28.9%(17號)，單體缺失畸變p16位點17.3%。③7號染色體的多體畸變與腫瘤的病理分級間呈正相關(r=18.632,P<0.001), 其余三種染色體畸變與腫瘤的病理分級無相關性。結論 對尿路上皮腫瘤患者進行FISH檢側是一種無創、有效的檢測方法。尿路上皮腫瘤在3、7 和17 號染色體及p16位點同時存在多種畸變類型，7號染色體多體畸變可預測尿路上皮腫瘤的進展。

熒光原位雜交； 尿路上皮腫瘤； 染色體畸變

尿路上皮腫瘤包括腎盂癌、輸尿管癌、膀胱癌以及尿道上皮癌, 以膀胱癌最為常見。膀胱癌是全世界第五大常見癌癥之一，其發病率且復發率高，早期診斷對于提高患者生存率有著非常重要意義[1]。常規的診斷方法為尿脫落細胞學檢查和膀胱鏡、輸尿管鏡檢查，前者的敏感性較低，而后者為有創檢查，增加患者痛苦。近年來，通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術檢測尿液中脫落細胞染色體異常從而早期診斷膀胱癌已成為熱點，Skacel等[2]研究顯示FISH在膀胱癌的診斷中有較高的敏感性，且為無創檢查。本研究采用FISH技術檢測3、7、17號染色體及p16區帶位點的畸變情況，并對尿路上皮腫瘤的分級分期進行相關研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年10月至2014年4月我科收治的尿路上皮腫瘤的患者共138例，其中膀胱尿路上皮癌111例、腎盂尿路上皮癌17例、輸尿管尿路上皮癌6例、低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例、腎盂癌并發輸尿管癌2例。男性100例, 女性38例，年齡31～87歲，平均62.3歲。按2004WHO腫瘤病理分級標準分類，低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例，低分級尿路上皮乳頭狀癌44例，高分級尿路上皮乳頭狀癌92例。所有患者均行尿FISH檢測、尿脫細胞學檢測、腹部超聲、泌尿系CT或膀胱鏡、輸尿管鏡檢查。同時設對照組20例，男性15例，女性5例，計算FISH檢測閾值。

1.2 儀器和試劑 熒光原位雜交操作平臺(OLYMPUS BX51系統顯微鏡，OLYMPUS BX-UCB通道轉換系統，熒光燈，DELL微型計算機，Progres Capture Pro2.5攝像系統,VIDEOTEST-FISH2.0 圖像分析處理系統),水浴鍋和電熱恒溫培養箱，離心機，烤片機，試劑盒-探針來自北京金菩嘉醫療科技有限公司，分為兩組CSP3/CSP7 綠色/ 紅色)和GLP16/CSP17(紅色/綠色)。

1.3 FISH檢測技術 將預先收集的晨尿50～100ml，離心10min,1500 r/ min, 去上清，加膠原酶消化，37℃ 消化20 min。 1500 r/ min 離心10 min, 去上清, 加5 ml 預熱的0.075 mol/ L KCl 低滲溶液,37℃ 低滲15 min，固定：加2 ml 固定液( 甲醇∶冰醋酸3∶1), 混勻, 1500 r/ min離心10 min, 去上清；加入5 ml 固定液，1500r/ min 離心10 min,重復固定1 次， 離心去上清后滴片，56℃中老化玻片60min。玻片處理：將玻片置于2×SSC中漂洗2次，每次5 min，玻片再置于預熱胃蛋白酶粉中浸泡5 min，再次放入于2×SSC中漂洗2次，每次5 min，最后依次置于70% 、85% 、100% 乙醇中脫水每次3 min。變性雜交：暗處：將玻片在變性液中浸泡5 min，梯度脫水。玻片自然干燥后, 試劑滴在雜交區域，封片置于預熱的濕盒中, 42℃恒溫箱中過夜。雜交后洗滌：移去蓋玻片,甲酰胺/ 2×SSC 溶液洗滌玻片,每次10 min，置于2×SSC、2×SSC、NP-40溶液中，每次5 min。梯度脫水后暗處干燥。加DAPI于雜交區域復染，10 min后觀察結果。

1.4 FISH閾值建立 FISH閾值來自20例健康成人尿液，FISH檢測結果，具體方法如下：每例樣本隨機計數細胞至少100個，3號、7號及17號染色體各需要建立兩個閾值(1個信號點，大于和等于3個信號點)，P16需要建立3個閾值(0個信號點，1個信號點，大于和等于3個信號點)。以公式 “閾值=平均值 + 3×標準差(SD)”。

1.5 FISH結果及判斷 熒光顯微鏡下觀察，選擇雜交信號均勻的區域，分析大的、不典型的、細胞核不規則的細胞，細胞重疊、破損、未去除細胞質的細胞核不計數，微弱雜交信號不計數。上下調節焦距，以免遺失信號，細胞內雜交信號互相靠近且兩雜交信號之間距離小于1個雜交點大小者計為1個信號。記錄信號類型即每個細胞核中紅綠信號點的個數，正常細胞的CSP3、CSP7、CSP17著絲粒探針及GLPp16位點探針均表現為二倍體，即細胞核分別可以看到2紅2綠為正常信號，見圖1。

圖1 正常成人尿液樣本FISH檢測結果

Figure 1 FISH detection of CSP3,CSP7,GLP16 and CSP17 in the urine samples of healthy adult

注：圖A CSP3為綠色熒光、CSP7為紅色熒光，圖BGLP16為紅色熒光、CSP17為綠色熒光

陽性結果判斷標準: 記錄信號類型即每個細胞核中紅綠信號點的個數，每例標本每種探針分析100個細胞核。見圖2。CSP3為綠色/CSP7為紅色可見3、

圖2 尿路上皮腫瘤患者尿液樣本FISH檢測信號圖

Figure 2 FISH detection of CSP3,CSP7,GLP16 and CSP17 in the urine samples of urothelial cancer patient

注：圖A CSP3為綠色熒光、CSP7為紅色熒光，圖BGLP16為紅色熒光、CSP17為綠色熒光

CSP3/CSP7號染色體組雜交后信號點熒光信號為綠色/紅色，可見3號、7號染色體擴增。GLP16/CSP17均表現為紅色/綠色，可見P16位點缺失、17號染色體擴增。

7號染色體有不同程度擴增均多于2個信號點，GLPp16為紅色/CSP17為綠色，17號染色體不同程度擴增多于2個信號點，P16基因缺失1個或0個信號點。①任意兩個以上位點(含兩個)出現異常，如3號和7號染色體出現非整倍增加，可判斷為陽性。②一個位點有兩種以上(含兩種)異常，如P16有0個信號點和3個信號點異常，可判斷為陽性。③若只有一個位點出現異常，擴大計數細胞后再重新判斷。

1.6 尿脫落細胞學檢查 標本采集(留取尿液)-涂片固定-HE染色-鏡檢-結果(陽性或陰性)。尿脫落細胞學檢測由兩位固定的高年資病理科醫師進行診斷。

1.7 病理結果 取患者活檢或術后組織標本行常規病理檢查，由兩名以上專業的病理醫師共同閱片診斷。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0統計分析軟件進行χ2檢驗，采用spearman分析各染色體畸變檢出率與臨床病理分級、分期之間的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 閾值結果 各染色體畸變的臨界值稱之為閾值。正常成人尿液樣本FISH檢測閾值，見表1。

2.2 FISH與尿脫落細胞學檢查腫瘤陽性檢出率比較 138例尿路上皮癌患者中，FISH檢測結果陽性者為134例，陰性者為4例。得出FISH靈敏度為97.1%(134/138)，特異度為100%。尿脫落細胞學結果中僅有6例尿液中發現癌細胞，靈敏度為11.5%(16/138)，特異度為100%。FISH 檢測膀胱尿路上皮癌的靈敏度高于尿脫落細胞學檢查(P<0.01)，而兩者的特異度差異無顯著統計學意義(P>0.05)。

2.3 FISH檢測結果及各染色體畸變率分析 根據建立閾值，判斷各染色體及區帶畸變發生率。多體畸變發生率由高到低依次為82.6%(7號)、71.7%(17號)、66.6%(3號)和49.2%(p16位點)。單體畸變發生率由高到低依次為53.6% (p16位點)、36.9%(7號) 、34.7% (3號)和28.9% (17號)。單體缺失畸變p16位點17.3%。

2.4 各染色體畸變與腫瘤病理分級的關系 在138例患者中病理結果證實為尿路上皮腫瘤，按照2004年WHO腫瘤病理分級標準，低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例，低分級尿路上皮乳頭狀癌44例，高分級尿路上皮乳頭狀癌92例。本組資料顯示，僅7號染色體的多體畸變與腫瘤的病理分級間呈正相關(r=18.632,P<0.001)，其余三種染色體及區帶不同類型的畸變情況均未顯示出與病理分級間無相關性，見表2。

表1 正常成人尿液樣本 FISH 檢測閾值

注: CSP3、CSP7、CSP17 分別表示3、7 和17 號染色體著絲粒熒光探針, GLP16 表示9p21位點特異性熒光探針。

表3 CSP3、CSP7、GLP16和CSP17染色體畸變與腫瘤病理分級的關系

注：PUNLMP(低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤)、LGPUC(低分級尿路上皮乳頭狀癌)、LGPUC(高分級尿路上皮乳頭狀癌)

3 討論

FISH是應用已知熒光染料單鏈核酸為探針，按照堿基互補原則，與待檢標本中核酸特異性結合，形成可被測的雜交雙鏈核酸。從而對待檢標本在熒光顯微鏡下進行染色體數目或結構異常分析。自2000年Sokolova等[3]建立首個膀胱尿路上皮癌FISH探針以來，目前基本確立將3、7、17號染色體及9號染色體P16位點探針作為常規檢測目標，結果顯示FISH的敏感性高達74.68%，這對于尿路上皮癌的早期診斷十分重要。本研究對138例尿路上皮腫瘤患者的尿液脫落細胞和FISH檢測顯示，兩種方法特異度均為100%，但FISH的靈敏度(97.1%)明顯高于尿脫落細胞學檢查(11..5%)。由此，FISH在尿路上皮腫瘤的診斷中優于尿脫落細胞學檢測。

2001年7月被FDA批準用于膀胱腫瘤的檢測，其主要研究染色體數目和結構畸變。Sandberg 等[4]在1994年對泌尿腫瘤染色體研究認為，尿路上皮癌易發生染色體改變，其中包括結構畸變和染色體數目異常，常見結構畸變染色體有3、9、1、5、11、21、17 號染色體，染色體數異常見于3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 號染色體。目前臨床上用于診斷尿路上皮癌的常用染色體主要有: 3、7、9、17 號染色體。3號染色體多倍體表達與膀胱尿路上皮癌的病達76.00%,定位于3p25的RAFI基因過理分級相關[5,6]。7號染色體多倍體發生率大約為76.20%[7]。其多倍體與病理分期、分級顯著相關, 7號染色體畸變可能在膀胱尿路上皮癌發生、發展中起重要作用[8]。

尿路上皮癌，尤其是膀胱尿路上皮癌的發病率在人群中可高達0.1%，其中約70%為非肌層浸潤性腫瘤，30%為肌層浸潤性膀胱腫瘤，有報道[9]稱Ta、Tis、T1期腫瘤進展為肌層浸潤的比率分別為5%、54%和46%。此外腫瘤的分級也與腫瘤進展有關，G1、G2、G3 腫瘤進展為肌層浸潤的比率分別為2%、11%和45%[10]。因此，淺表性膀胱癌患者需術后隨訪以便及時發現腫瘤的復發。

4 結論

FISH技術具有敏感度高、特異性強、無創性等優點，在尿路上皮腫瘤早期診斷及術后監測中具有較高的應用價值。尤其在各染色體及區帶畸變發生率中，以多體畸變為主。此外，7號染色體的多體畸變與尿路上皮腫瘤的病理分級間呈正相關，有望成為尿路上皮腫瘤進展和侵襲的標記物。

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Application of fluorescence in situ hybridization technique in diagnosis of urothelial tumor

ZHOU Yi，FANG Qiang，CHEN Zhi-wen，etal

(InstituteofUrinarySurgery,SouthwestHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To investigate the role of fluorescence in situ hybridization technician in the diagnosis of urothelial tumors.Methods FISH diagnostic threshold was established by 20 cases of healthy adults. 138 cases of urothelial cancer patients were performed urine cytology and FISH detection of chromosome 3, 7 and 17 and abnormal p16 locus, the diagnostic value of two methods and the relationships between chromosomal aberrations and pathological grade were analyzed. Results The sensitivity of Urine cytology and FISH was 11.5% and 97.1% respectively, the difference was statistically significant (P<0.01). Each chromosome and zone showed a higher incidence of distortion. The incidence of multiple aberrations were 82.6% (7), (17) 71.7%, 66.6% (3) and 49.2% (p16). The incidence of monomer distortion were 53.6% (p16), 36.9% (7), 34.7% (3) and 28.9% (17). The incidence of p16 locus monomer distortion rate was 17.3%. The 7th chromosome multi-body aberrations was positively correlated with tumor pathological grade (r=18.632,P<0.001). Conclusion FISH is a noninvasive and effective detection method for urothelial tumors. The multi-body aberration of 7th chromosome is predictable for progress of urothelial tumors.

Fluorescence in situ hybridization; Urothelial tumors; Chromosome aberration

國家自然科學基金(81172441)

方強，E-mail:fangqiang@tmmu.edu.cn

R 737.15

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.008

2014-11-03； 編輯： 張文秀)