外源NO調控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發生理特性及抗氧化酶的研究

劉文瑜，楊宏偉，魏小紅，劉博，王高強，吳偉濤

(甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070)

外源NO調控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發生理特性及抗氧化酶的研究

劉文瑜，楊宏偉，魏小紅*，劉博，王高強，吳偉濤

(甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070)

摘要：本試驗以蒺藜苜蓿種子為材料，預先用0.1,0.3和1.0 mmol/L 硝普鈉(SNP, NO 供體)浸種，通過計算相關萌發指標，測定種子萌發過程中各項生理指標及抗氧化系統酶活性，研究外源NO對2.0% NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發生理特性及活性氧代謝的影響。結果表明,0.1 mmol/L SNP能顯著緩解鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子造成的傷害，使蒺藜苜蓿種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別提高了333.40%，79.64%，171.93%和100.00%；種子可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分別提高了21.1%,42.3%和123.1%，淀粉含量降低了17.7%，淀粉酶活性提高了29.7%，丙二醛(MDA)和超氧陰離子(O2-·)含量分別降低了21.8%和27.2%，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性分別增加了28.6%,43.1%,56.2%和60.3%；與0.1 mmol/L SNP處理相比，0.3 mmol/L SNP處理對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發的促進、氧化損傷的緩解和抗氧化系統酶活性的提高顯著降低；1.0 mmol/L SNP處理對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發起到抑制作用。說明低濃度的NO可通過降低種子MDA和O2-·含量，提高種子脯氨酸含量以及激活抗氧化系統酶活性，減輕鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子的傷害，促進淀粉、可溶性蛋白的水解，從而加速種子萌發。

關鍵詞：一氧化氮；鹽脅迫；蒺藜苜蓿；種子萌發；抗氧化酶

土壤鹽害已成為影響植物種子萌發、作物生長和產量的主要生物脅迫之一。鹽害可導致植物體內超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基的積累，大量積累的活性氧引起脂質、蛋白質和核酸氧化進而造成細胞損傷。植物則通過提高抗氧化系統酶活性，減輕鹽脅迫的傷害。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是廣泛存在于植物體內的氣體小分子信號物質。植物體內NO的合成主要依賴于一氧化氮合酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)。NO在植物體內是致毒還是起到保護作用取決于胞內環境、作用部位。一方面當胞內NO濃度高時，NO可作為一種自由基參與反應而破壞生物大分子的結構與功能，對生物體產生氧化損傷；另一方面當胞內活性氧濃度較低時，NO可中斷活性氧鏈式反應，對細胞起到保護作用；另外NO在植物生長發育過程中起到關鍵作用，包括破除種子休眠、植物體新陳代謝、氣孔運動、光合作用、呼吸作用[10]、成花生理[11]等；在旱害、鹽害、冷害以及病原菌侵染等逆境脅迫應答中也起著重要作用[2]。硝普鈉(SNP)是現已廣泛使用的外源NO供體，0.5 mmol/L SNP可以釋放約2.0 μmol/L的NO[2]。研究發現，低濃度的硝普鈉(SNP)處理明顯緩解鹽脅迫下水稻 (Oryzasativa)幼苗根組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)的積累，顯著提高可溶性蛋白含量，并誘導根系抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate, APX)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的上升，而高濃度SNP處理效果則相反[13]；外源NO能提高干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum)幼苗葉片中SOD、POD和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性, 降低超氧陰離子(O2-·)和過氧化氫(H2O2)水平, 緩解膜脂過氧化, 穩定生物膜的結構和功能[14]；外源NO能顯著提高鹽脅迫下番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗葉片抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性及脯氨酸和可溶性糖含量，降低MDA和O2-·含量[15]。

蒺藜狀苜蓿(Medicagotruncatula)為豆科苜蓿屬一年生植物，因其種子莢果螺旋緊密，外被尖刺，形似蒺藜，因此稱為蒺藜狀苜蓿，也稱為截葉苜蓿或截形苜蓿。蒺藜狀苜蓿原產地中海地區，在澳大利亞南部許多較為干旱的地區種植蒺藜苜蓿已非常普遍，我國主產區為河南、河北、山東、安徽、江蘇、四川、山西、陜西等省[16]。由于蒺藜苜蓿與紫花苜蓿等豆科植物遺傳關系近，基因組小，生長周期短，有較高的生物多樣性；另外，蒺藜苜蓿固氮效率高，其次生代謝產物豐富，因此，在近年的比較基因組學研究中發揮著重要作用[17]，而有關蒺藜苜蓿耐鹽機制尚未見報道；同時，由于近年來土壤鹽漬化加劇，提高蒺藜苜蓿耐鹽性迫在眉睫。為此，本文通過外源NO處理2.0% NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子，對蒺藜苜蓿種子萌發及種子萌發過程中可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉、脯氨酸、MDA含量、O2-·產生速率及SOD、POD、CAT和APX活性變化的研究，探討外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發的影響，以期為提高蒺藜苜蓿耐鹽性及揭示其耐鹽性機理提供理論依據。

1材料與方法

1.1　試驗材料及處理

試驗以蒺藜苜蓿品種“WM5106”為材料。由揚州大學提供，千粒重為3.086 g，室溫避光貯存備用。

本試驗于2013年4-5月在甘肅農業大學生命科學技術學院植物生理實驗室進行。挑選大小一致、飽滿且無病蟲害的種子，用0.2%HgCl2溶液浸泡消毒5 min，蒸餾水沖洗5~6次后，分別做如下處理，處理一：分別用不同濃度的NaCl (0，0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%)溶液處理；處理二：分別用蒸餾水，0.1，0.3，1.0 mmol/L SNP溶液浸泡48 h后，用2.0% NaCl處理，即CK、2.0% NaCl、0.1 mmol/L SNP+2.0% NaCl、0.3 mmol/L SNP+2.0% NaCl、1.0 mmol/L SNP+2.0% NaCl。將處理后的種子置于墊有雙層濾紙的培養皿(φ=9 cm)中，每皿50粒種子，每個處理均重復3次。以蒸餾水為對照(CK)，每皿中分別加入8 mL對應的溶液，將所有培養皿置于溫度(25±1)℃，12 h光照/12 h黑暗、濕度80%恒溫培養箱中，培養7 d后統計幼苗相關萌發指標；分別在對處理二(CK、2.0% NaCl、0.1 mmol/L SNP+2.0% NaCl、0.3 mmol/L SNP+2.0% NaCl、1.0 mmol/L SNP+2.0% NaCl)進行處理后的第0，2，4，6天測定相關生理指標，并做POD同工酶電泳。

1.2　測定指標與方法

1.2.1種子發芽指標萌發處理后以胚根長為種子長的2倍，胚芽與種子等長作為萌發標準，每天統計發芽的種子數后計算發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數(發芽指數與種子平均鮮重的乘積再除以測試種子的數量)。計算公式如下：

發芽率(GP)=7 d發芽種子數/測試種子總數×100%[18]

發芽勢(GE)=前3 d發芽種子數/種子總數×100%[18-19]

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)[20]

式中，Dt為日發芽種子數，Gt為與Dt相應的每天的發芽種子數。

活力指數(VI)=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[21]

式中，幼苗鮮重為稱取5株幼苗的重量。

1.2.2生理指標測定可溶性糖采用蒽酮比色法測定[22]；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍比色法測定[23]；脯氨酸采用酸性茚三酮法測定[24]；淀粉采用蒽酮比色法測定[22]；淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸法測定[23]；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[24]；超氧陰離子(O2-·)產生速率參照王愛國和羅廣華[25]的方法測定；參照Zhu等[26]，An和Liang[27]的方法提取抗氧化酶酶液，超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Huang等[28]的方法測定；過氧化物酶(POD)活性參照Shi等[29]的方法測定；過氧化氫酶(CAT)活性參照Aebi[30]的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶 (APX)活性參照Nakano和Asada[31]的方法測定。

1.2.3過氧化物同工酶分析采用不連續系統聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳[32-33]；染色采用改良的聯苯胺染色法[33-34]。

1.3　數據分析

每個指標測定重復3~5次。采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，數據結果以“平均值±標準誤”表示，用Sigma Plot 12.5 作圖。

2結果與分析

2.1　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發的影響

蒺藜苜蓿種子采收當年種子硬實率較高，達到70%~80%[35]。從表1 可知，與對照相比，隨著NaCl濃度的升高，蒺藜苜蓿種子的發芽率 (G)、發芽勢 (GE)、發芽指數(GI)和活力指數 (VI)均呈現先上升后下降的變化趨勢，不同處理間差異顯著(P<0.05)。其中，0.5%NaCl處理的蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI顯著高于對照和其他處理，分別比對照提高了100.04%，257.51%，28.52%和161.54%；而2.0%NaCl處理的蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI最低，分別比對照降低了78.57%，49.85%，65.77%和92.31%。

表1　不同濃度NaCl 對蒺藜苜蓿種子萌發的影響

注：同列數值不同小寫字母表示差異達5%顯著水平，下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 5% level, the same below.

從表2 可知，鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI顯著低于對照(CK)(P<0.05)，G、GE、GI和VI分別比CK降低了78.57%，49.85%，65.77%和92.31%。0.1和0.3 mmol/L SNP預處理顯著提高了鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI，其中，0.1 mmol/L SNP預處理后，蒺藜苜蓿種子的G、GE、GI和VI比單獨鹽處理下提高了333.40%，79.64%，171.93%和100.00%；1.0 mmol/L SNP預處理下蒺藜苜蓿種子的G和GI顯著低于單獨用鹽處理，且二者間GE和VI差異不顯著。表明鹽脅迫顯著抑制了蒺藜苜蓿種子的萌發，低濃度的SNP溶液可以明顯促進鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發，而高濃度的SNP溶液則起到抑制作用。

表2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發的影響

2.2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量變化的影響

如圖1A 所示，鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中可溶性糖含量顯著降低，并且隨發芽處理時間的延長呈現先上升后下降再上升的變化趨勢，在處理的第2、4、6天，分別比CK降低了22.3%，33.1%和27.0%。SNP預處理提高了鹽脅迫下種子萌發過程中可溶性糖含量，在第2天不同處理下可溶性糖含量達到最大值，不同濃度SNP與鹽一起處理的比單獨用鹽處理的分別提高了21.1%，12.6%和5.9%。

如圖1B所示，對照和其他處理下蒺藜苜蓿種子萌發過程中可溶性蛋白含量隨萌發時間的延長先升高后降低，并在第2天達到最大值。與CK相比，鹽脅迫下種子萌發過程中可溶性蛋白含量顯著下降，在處理的第2~6天分別比CK降低了27.8%，32.4%和41.1%。與2.0% NaCl處理相比，在處理的第2~6天內，不同濃度SNP預處理顯著提高了鹽脅迫下種子萌發過程中可溶性蛋白的含量，其中0.1 mmol/L SNP預處理效果最佳，比單獨鹽脅迫處理分別提高了42.3%，20.0%和54.6%。

如圖1C所示，隨著發芽時間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發過程中脯氨酸含量先上升后下降，在處理的2~6 d內不同處理間差異顯著。鹽脅迫處理顯著增加了種子萌發過程中脯氨酸含量，并在第4天達到最大值，比CK增加了19.4%，而后緩慢下降，在整個處理過程中都始終高于CK。與2.0% NaCl處理相比，不同濃度SNP預處理顯著提高了鹽脅迫下種子萌發過程中脯氨酸含量，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預處理的種子內脯氨酸含量比單獨用鹽處理的分別提高了123.1%，74.3%和52.0%。

圖1　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中

2.3　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中淀粉含量和淀粉酶活性的影響

外源NO對NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子淀粉含量和淀粉酶活性的影響見圖2。從圖2A中可以看出，各處理下蒺藜苜蓿種子內淀粉含量隨著發芽時間的延長呈現逐漸下降的變化趨勢。在整個處理過程中，用不同濃度SNP與鹽一起處理的種子內淀粉含量始終高于CK，但又均顯著低于單獨用鹽處理；在處理的第2天，各處理組種子內淀粉含量差異不顯著；在處理的第4天，各處理下蒺藜苜蓿種子內淀粉含量迅速下降，在處理的第6天，各處理下種子內淀粉含量仍持續下降并達到最低點；其中，0.1 mmol/L SNP與鹽一起處理的種子內淀粉含量比單獨用鹽處理降低了17.7%。

圖2　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中淀粉含量(A)和淀粉酶活性(B)的影響Fig.2　Effects of exogenous NO on the starch content(A) and amylase activity(B) in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

相同處理天數不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different letters in the same treatment time mean significant difference atP<0.05, the same below.

如圖2B所示，隨著發芽時間的延長，蒺藜苜蓿種子內淀粉酶活性逐漸升高。種子萌發過程中，用不同濃度SNP預處理的種子內淀粉酶活性始終顯著高于單獨用2%NaCl處理，但又均顯著低于CK。在處理的第6天，用0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預處理的種子內淀粉酶活性比單獨用2%NaCl處理分別高29.7%，19.1%和7.5%。說明用SNP浸種緩解了NaCl脅迫對蒺藜苜蓿種子內淀粉酶活性的抑制作用，提高種子內淀粉酶活性，從而促進淀粉的水解，誘導種子的萌發。

2.4　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中MDA和O2-·產生速率的影響

由圖3A 可知，隨著發芽時間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發過程中MDA 含量逐漸升高，整個處理過程中，各處理間差異顯著。與CK相比，鹽脅迫下種子萌發過程中MDA 含量顯著上升，在第6天達到最大值，比CK高84.4%。SNP預處理顯著抑制了鹽脅迫下種子萌發過程中MDA含量的增加，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP與鹽一起處理的比單獨用鹽處理的減少了21.8%，18.2%和13.5%。

由圖3B可知，隨著發芽時間的延長，蒺藜苜蓿種子萌發過程中O2-·產生速率逐漸加快，整個處理過程中，各處理間差異顯著。鹽脅迫明顯促進了種子萌發過程中O2-·的產生，在處理的第6天，種子萌發過程中O2-·產生速率達到最大值，比CK高156.7%。與單獨用鹽處理相比，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP預處理顯著降低了種子萌發過程中O2-·的產生速率，在處理的第6天，比鹽脅迫處理分別減小了27.2%，21.1%和14.3%。

以上結果說明鹽脅迫促進了蒺藜苜蓿種子萌發過程中活性氧的積累，而SNP預處理后顯著緩解了鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子萌發造成的氧化損傷。

圖3　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中MDA(A)和O2-·產生速率 (B)的影響Fig.3　Effects of exogenous NO on the MDA (A) content and O2-·production rate (B) in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

2.5　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中抗氧化酶活性的影響

1) SOD 活性:外源NO對NaCl脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中SOD活性的變化如圖4A所示。從圖中可以看出，隨著發芽時間的延長，各處理下種子內SOD活性呈現先升高后降低的變化趨勢。種子萌發的過程中，對照組種子內SOD活性變化較緩，在第2天有小幅上升，到第6天有小幅下降；而種子在經過單一的NaCl處理后，SOD活性在第2天到第4天快速上升，同時期經不同濃度SNP處理的種子內SOD活性也呈現迅速上升的變化趨勢，其中，0.1 mmol/L SNP預處理下種子內SOD活性最高，比單獨用NaCl處理顯著提高了90.8%，即使到處理結束時，SOD活性雖有下降，但是仍比單獨用NaCl處理高43.9%。說明SNP預處理種子可以在一定程度上提高種子萌發過程中SOD活性。

2) POD活性:如圖4B所示，隨著發芽時間的延長，對照組(CK)和其他4種處理下蒺藜苜蓿種子內POD活性呈先升高后下降的變化趨勢。在整個萌發過程中， CK種子內POD變化較為平緩。在第4天，各處理下種子內POD活性快速上升，各處理間差異顯著(P<0.05)，并達到最大值，而且不同濃度SNP+2.0% NaCl處理種子內POD活性顯著高于單獨用2.0%NaCl處理，其中，以0.1 mmol/L SNP處理下種子內POD活性最高，比單獨使用2.0%NaCl處理高30.6%，處理的第6天，不同濃度SNP+2.0%NaCl處理的種子內POD活性呈現不同程度的下降，但是仍顯著高于單獨用2.0%NaCl處理和CK。

3) CAT活性:圖4C顯示，隨著發芽時間的延長，在正常條件下，蒺藜苜蓿種子內CAT活性呈現相對穩定的變化趨勢(P>0.05)；而在整個處理過程中，其他各處理下種子內CAT活性隨著處理時間的延長呈現先升后降的變化趨勢。其中，在處理的第2天，各處理間CAT活性差異不顯著；在第4天，各處理的種子內CAT活性迅速上升并達到最大值，而且不同濃度SNP+2.0%NaCl處理種子內CAT活性顯著高于單獨用2.0%NaCl處理，其中，以0.1 mmol/L SNP處理下種子內CAT活性最高，比單獨使用2.0%NaCl處理高123.9%，處理的第6天，不同濃度SNP+2.0%NaCl各處理下種子內CAT活性雖有不同程度下降，但是仍顯著高于單獨用2.0%NaCl處理和CK。

圖4　外源NO 對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中SOD(A)、POD(B)、CAT(C)及APX (D)活性的影響Fig.4　Effects of exogenous NO on the SOD (A), POD (B), CAT (C) and APX (D) activities in germinating M. truncatula seeds under NaCl stress

4) APX 活性:圖4D顯示，鹽脅迫顯著提高了蒺藜苜蓿種子萌發過程中APX的活性，并且隨著發芽時間的延長逐漸升高，在第4天達到最大值，比CK提高了71.1%，以后緩慢下降，整個處理過程中，CK中APX活性變化緩慢。與單獨用鹽處理相比，SNP與鹽一起處理顯著提高了種子萌發過程中APX的活性，在處理的第6天，0.1，0.3和1.0 mmol/L SNP與鹽一起處理比單獨用鹽處理的增加了60.3%，51.5%和39.7%。

圖5　外源NO 調控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中POD 同工酶電泳圖譜Fig.5　Effects of exogenous on the POD isoenzyme electrophoresis atlas of M. truncatula germinating seeds under NaCl stress　　　泳道1~3：對照組2,4,6 d；4~6：2% NaCl處理的2，4，6 d；7~9：0.1 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d；10~12：0.3 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d；13~15：1.0 mmol/L SNP+2% NaCl處理的2，4，6 d。 Lane 1-3: CK 2, 4, 6 d; 4-6: 2% NaCl 2, 4, 6 d; 7-9: 0.1 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d; 10-12: 0.3 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d; 13-15: 1.0 mmol/L SNP+2% NaCl 2, 4, 6 d.

2.6　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中POD同工酶的影響

如圖5所示，共出現了7條酶帶。其中，A5為共有酶帶，酶帶寬且顏色深。CK的第4和6天出現了A1、A2和A3 3條酶帶，其中A1和A3酶帶較寬且顏色較深，但A2酶帶顏色淺；無論CK、鹽脅迫或SNP與鹽復合處理，在整個處理過程中均出現了A4酶帶，但帶較細且顏色淺；鹽脅迫下A6酶帶顏色加深且帶變寬，而正常條件下A6酶帶顏色較淺，SNP預處理的A6酶帶顏色比CK深，卻比單獨用鹽處理的淺；用CK或SNP預處理的種子萌發過程中出現了A7酶帶，但顏色較淺。

3討論

3.1　外源NO調控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發

種子是植物為躲避惡劣環境以進行種群延續的一種重要機制[36]，種子萌發是植物生活史中的關鍵過渡階段(從種子到幼苗)[37-38]。種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均可以反映種子發芽能力。一般情況下， 發芽率與種子生活力是一致的，因此在生產上通常將種子的發芽率作為鑒定種子質量的重要指標之一；發芽指數反映了種子發芽的速率和整齊程度，種子活力是種子在較廣范圍內迅速生長及生長整齊度的指標[39]。研究表明低濃度的鹽脅迫對種子萌發和幼苗生長有促進作用，高濃度則有抑制作用[40]。本試驗結果表明用0.2%~1.0% NaCl處理蒺藜苜蓿種子后均可以提高種子發芽率，其中以1.0%的處理最好，而1.5%和2.0%NaCl浸種后種子的發芽率低于對照，說明低濃度的NaCl可以促進蒺藜苜蓿種子萌發，而高濃度NaCl對種子萌發起到抑制作用。

SNP是一種常用的外源NO供體。NO作為一種信號分子和活性氧清除劑，能調節植物對生物和非生物脅迫的適應及反應[41]。湯紹虎等[41]研究發現0.1 mmol/L SNP可以顯著促進滲透脅迫下黃瓜(Cucumissativus)種子的萌發和幼苗生長；Kopyra[42]以外源NO 供體SNP處理羽扇豆(Lupinusluteus)種子, 有效提高了鹽脅迫下種子的萌發率、萌發速率及胚根的長度。本試驗結果表明，0.1和0.3 mmol/L SNP預處理蒺藜苜蓿種子，可以顯著提高鹽脅迫下種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數，而1.0 mmol/L SNP預處理后種子的各項萌發指標反而低于單獨用鹽處理。說明低濃度的NO可以促進鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子的萌發，而高濃度的NO對種子萌發起到抑制作用。

3.2　外源NO對鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子物質代謝的影響

種子萌發過程中需要物質和能量來維持其旺盛的生命活動[43]。種子在萌發期間所需的養料和能量主要來自貯藏物質的轉化和利用[44]。種子內主要的貯藏物質為淀粉、脂肪和蛋白質。這些物質在種子萌發過程中水解為簡單的營養物質，并運轉到生長部位作為構成新組織的成分和產生能量的原料[45]。周萬海等[46]研究表明鹽脅迫下添加外源NO可以使甘農4號和阿爾岡金2個苜蓿品種淀粉酶活性顯著提高，淀粉含量降低，可溶性糖含量升高；鄭春芳等[47]研究表明0.1 mmol/L SNP預處理能顯著提高小麥葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量。本試驗結果表明鹽脅迫顯著降低了淀粉酶活性，抑制了淀粉的水解，抑制了可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加；而0.1和0.3 mmol/L SNP預處理后顯著降低了種子內淀粉含量，提高了淀粉酶活性，增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量。說明外源NO增強了鹽脅迫下種子內淀粉酶活性，促進了種子內淀粉的水解，淀粉僅作為一種暫時的貯藏物質，不斷的水解為可溶性糖以滿足種子萌發生長所需要的營養物質。

脯氨酸在植物滲透調節中起著重要作用，可以清除活性氧，提高抗氧化能力，穩定生物大分子結構，降低細胞酸性，解除氨毒等[48]-49。樊懷福等[48]研究表明0.01~0.40 mmol/L SNP 能顯著緩解鹽脅迫對黃瓜植株造成的傷害，提高葉片脯氨酸含量，其中以0.1 mmol/L SNP 緩解效果最好。本試驗結果表明鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中脯氨酸含量顯著上升，不同濃度SNP預處理后促進了種子萌發過程中脯氨酸含量的積累，其中以0.1 mmol/L SNP 促進效果最明顯。說明外源NO預處理促進了鹽脅迫下種子萌發過程中脯氨酸的積累，從而緩解了鹽脅迫對種子萌發造成的抑制作用。

3.3　外源NO調控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子MDA、O2-·產生及抗氧化酶活性

植物種子萌發需要的物質與能量是由胚乳和糊粉層貯藏的營養物質分解和氧化磷酸化提供的，能量代謝過程中會產生大量的活性氧，從而對細胞和組織造成氧化損傷[50]。植物的保護酶體系在緩解脅迫方面起著重要作用，它可以清除體內的活性氧，以避免過量活性氧對植物的傷害[51]。SOD 作為膜保護的第一道防線，能以O2-為基質進行歧化反應，將毒性較強的O2-轉化為毒性較輕的H2O2[52]，而CAT將H2O2歧化為H2O和O2，但是CAT清除H2O2的效率非常低[53]-54，POD則是利用各種基質作為電子供體將H2O2還原為H2O[54]-55。POD對CAT起協同作用[56]。劉建新等[57]研究表明噴施SNP預處理明顯降低了NaCl脅迫下葉片MDA和O2-·的積累，提高了SOD、POD、CAT和APX活性。孫立榮等[58]研究表明外施SNP顯著緩解了鹽脅迫導致的MDA含量和活性氧水平的增加，提高了鹽脅迫下幼苗葉子中SOD、POD、APX和CAT等抗氧化酶的活性。本試驗結果表明，鹽脅迫顯著提高了蒺藜苜蓿種子萌發過程中MDA含量，加快了O2-·產生速率，增加了SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性；不同濃度SNP預處理蒺藜苜蓿種子后，在種子萌發過程中MDA含量和O2-·產生速率受到不同程度的降低和抑制，并且顯著增強了SOD、POD、CAT和APX活性；其中以0.1 mmol/L SNP 緩解效果最好。說明外源NO 通過增強抗氧化酶活性，清除種子萌發過程中積累的活性氧，減輕鹽脅迫對種子萌發造成的氧化損失，從而加速種子萌發。

Reference：

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Effects of exogenous nitric oixde on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism ofMedicagotruncatulaunder NaCl stress

LIU Wenyu, YANG Hongwei, WEI Xiaohong*, LIU Bo, WANG Gaoqiang, WU Weitao

CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:Medicago truncatula seeds were pre-soaked with 0.1, 0.3 and 1.0 mmol/L sodium nitriprusside [SNP, a nitric oxide (NO) donor] solution to study the effects of nitric oxide on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism of M. truncatula under 2.0% NaCl stress. Damage to M. truncatula seeds caused by 2.0% NaCl stress was significantly alleviated in the presence of 0.1 mmol/L SNP. The seed germination percentage, germination energy, germination index and vigor index were increased 333.40%，79.64%，171.93% and 100.00%, respectively; while soluble sugar, protein and proline contents in seeds were increased by 21.1%, 42.3% and 123.1%, respectively. Starch content was decreased by 17.7%, amylase activity was increased by 29.7%, and MDA and O2-·contents were decreased by 21.8% and 27.2%, respectively. Activities of SOD, POD, CAT and APX in seeds were increased by 28.6%, 43.1%, 56.2% and 60.3%, respectively. Seed germination, oxidative damage and the antioxidant enzyme activities in seeds decreased when seeds were treated with 0.3 mmol/L SNP. When the concentration of SNP solution was increased to 1.0 mmol/L, we observed an inhibitory effect on seed germination. Our results provide evidence that lower concentrations of SNP may alleviate damage to seeds caused by salt stress. Key components of the response are: decreased MDA and O2-·levels, increased proline level and antioxidant enzyme activities in seeds, with resultant promotion of starch and protein hydrolysis, expedition of seed germination.

Key words:nitric oxide; salt stress; Medicago truncatula; seed germination; antioxidant enzyme

*通訊作者

Corresponding author. E-mail:weixh@gsau.edu.cn

作者簡介：劉文瑜(1985-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士。E-mail:yu850721.lemon@163.com

基金項目：甘肅省自然基金項目(2014GS04173)資助。

*收稿日期：2014-07-03；改回日期：2014-09-02

DOI：10.11686/cyxb20150211

http://cyxb.lzu.edu.cn

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