不同儲存年限老芒麥種子種帶真菌檢測及致病性測定

陳燾，南志標

(草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

不同儲存年限老芒麥種子種帶真菌檢測及致病性測定

陳燾，南志標*

(草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

摘要：對來自青海的5個不同收獲年份的老芒麥種樣進行了系統的種帶真菌研究；測定了12種分離率大于1%的種帶真菌對老芒麥種子萌發和幼苗生長的影響。結果表明，種樣發芽率為56%～80%，S2發芽率最高,達到80%，顯著高于S1和S5(P<0.05)；種樣帶菌率為24%～38%，隨儲藏時間延長呈下降趨勢，S5帶菌率最高，達到38%，顯著高于其他種樣(P<0.05)；共鑒定出老芒麥種帶真菌15屬17種，真菌分離率為0.25%～8.75%，其中青霉和曲霉是老芒麥最常見的種帶真菌，在5個種樣上均被分離得到；燕麥鐮孢、串珠鐮孢、鐮孢菌1、離蠕孢和德氏霉5種真菌是老芒麥最主要的致病真菌，均顯著地降低了老芒麥種子的萌發、抑制了幼苗的生長、降低了幼苗的生物量(P<0.05)；細交鏈孢對種子的萌發沒有顯著抑制作用(P>0.05)，但是顯著地降低了幼苗的長度和干物質產量(P<0.05)。皮思霉、離蠕孢、曲霉3種真菌顯著延長了老芒麥種子平均萌發時間，而燕麥鐮孢則顯著地縮短了種子平均發芽時間(P<0.05)。

關鍵詞：老芒麥；發芽率；種帶真菌；致病性

老芒麥(Elymussibiricus)是禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)披堿草屬(Elymus)多年生疏叢型中旱生植物，廣泛分布于北半球溫帶地區，主要集中在東歐、西伯利亞、中國、蒙古、朝鮮、日本及印度等；在我國主要分布在東北、華北、西北和青藏高原等地。老芒麥具有抗寒性強、適應性廣、品質好、草籽產量高等優點，是我國青藏高原地區廣泛栽培的優良牧草，常用于牦牛和藏羊等家畜的補飼飼料，在草地畜牧業中發揮著重要作用，同時對退化草地治理、三江源區生態環境保護等具有重要意義。

種子作為高等植物的繁殖器官，能夠攜帶大量危害種苗或植株的病原，既是病害的載體，同時也是受害者。而在所有病原中，真菌是對種子質量影響最為嚴重的一類。種帶真菌既可通過混雜于種子中間或粘附于種子表面，也可侵入種子組織內部，導致病害在時間上進行延續(從一個生長季到下一個生長季)和空間上進行擴展(從此地到彼地)。種帶病原真菌不僅對種子的萌發、幼苗的健康生長產生負面影響，而且能在貯藏期間降低種子的品質[10]。因此，對種子進行病原真菌及其攜帶量檢測是種子健康檢驗的重要組成部分[11]。

目前，國內外學者對多種植物種子進行了種帶真菌研究[12-14]。例如，Wiewióra和Prończuk[15]對多年生黑麥草(Loliumperenne)進行了種帶真菌檢測，分離出細交鏈孢(Alternariaalternata)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokuniana)、德氏霉屬(Drechsleraspp.)、黑色附球菌(Epicoccumnigrum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、枝孢屬(Cladosporiumsp.)等多種病原真菌。又如，李春杰和南志標[13]對來自新疆等11個省區的38個苜蓿(Medicago)種樣進行了種帶真菌檢測，共鑒定出36屬40種真菌，其中青霉(Pecinilliumsp.)、細交鏈孢、粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、多主枝孢(Cladosporiumherbarum)和黃曲霉(Aspergillusflavus)為苜蓿常見的種帶真菌, 且對種子或幼苗造成不同程度的危害。然而，關于老芒麥種帶真菌的研究幾乎屬于空白，僅見袁慶華等[16]對產自甘肅甘南的老芒麥種子進行了初步檢測。

近年來，隨著退耕還草、草原改良和人工草地建設等工程的實施，老芒麥的種植面積不斷擴大，種子需求量迅速增加[17]。因此，本研究主要通過對我國青藏高原地區的5個不同收獲年份的老芒麥種子進行種帶真菌檢測及分離，明確不同儲存年限的老芒麥種帶真菌區系，測定種帶真菌對種子萌發以及幼苗生長的影響，確定老芒麥主要致病真菌，從而為老芒麥種傳病害的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1　研究材料

供試老芒麥種子分別于2006，2007，2008，2009，2010年收獲于青海，4℃保存于農業部牧草與草坪草種檢中心種子庫(蘭州)。種樣編號依次為S1，S2，S3，S4，S5。試驗于2010年11月至2011年5月進行。

1.2　研究方法

1.2.1種子發芽率的測定采用培養皿紙上法(TP)，每種樣隨機取400粒凈種子，均勻擺放于鋪有兩層濾紙直徑120 mm培養皿中，每皿100粒，4次重復，25℃恒溫培養15 d，每天加水保濕。參照《國際種子檢驗規程》[18]，第5天初次統計發芽種子數，第15天發芽結束，計算種子發芽率。

1.2.2種帶真菌分離與鑒定參照李春杰和南志標[13]的方法，每種樣隨機取老芒麥種子200粒，經75%酒精浸泡1 min，用1% NaClO消毒2 min，用無菌蒸餾水充分洗滌5次，放置于無菌濾紙上進行干燥，然后用經火焰消毒的鑷子隨機選取10粒，等距離放置于ABPDA培養基上(內加100 mg/L鏈霉素和100 mg/L青霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)，4皿為一重復，4次重復，置于20℃恒溫培養箱中培養。第3天開始觀察菌落生長情況，及時挑取長出菌落至PDA培養基上純化培養，純化好的菌株置試管于4℃冰箱中保存，備用。待不再有新的菌落出現時統計帶菌種子數和帶某種真菌種子數，參照徐秀蘭等[19]的方法，計算種子帶菌率和真菌分離率：

種子帶菌率(%)=(帶菌種子數/檢測種子總數)×100

某菌分離率(%)=(帶某類菌種子數/檢測種子總數)×100

參考相關著作[20-21]，借助顯微鏡觀測孢子形態、孢子著生方式、測定孢子大小、孢子梗長度等形態學指標進行鑒定。

1.2.3種帶真菌致病性測定選取分離率大于1%的12種真菌分離物用于試驗。供試真菌接種于PDA培養基上在黑暗培養箱中培養2周后，打開皿蓋加入10 mL無菌水，用滅菌的解剖刀將孢子輕輕刮下，充分分散后配成孢子懸浮液，調整孢子濃度至1×106/mL，備用。

參照楊顏霞等[22]的方法，隨機選取400粒種子，在無菌條件下用1% NaClO消毒10 min，無菌蒸餾水充分潤洗5次，置于經滅菌的濾紙上干燥，用備好的孢子懸浮液2 mL接種24 h，對照用2 mL無菌蒸餾水代替。將接種過真菌孢子懸浮液的種子等距離放置于鋪有兩層無菌濾紙的滅菌培養皿(直徑12 cm)中，每皿100粒，重復4次,于25℃恒溫的光照培養箱中，12 h光照/12 h黑暗培養。每天記錄發芽種子數，15 d后按《國際種子檢驗規程》統計種子最終發芽數，分別計算種子最終發芽率(FGP)、發芽勢(GP)、平均發芽時間(MGT)。另外，每皿隨機取15株種苗測定芽長和根長，然后置于80℃烘箱中24 h，測定干重。

1.3　統計分析

用Microsoft Excel錄入數據并制表。采用SPSS 15.0進行方差分析和多重比較(Duncan法)。發芽率及發芽勢數據分析前反正弦轉換。

2結果與分析

圖1　不同收獲年份種樣發芽率和帶菌率Fig.1　Percentage of seed germination and seed-borne fungus infection among five seed samples of E. sibiricus　　　不同大寫和小寫字母分別表示不同種樣發芽率和帶菌率差異顯著(P<0.05，Duncan)。Different capital and small letters mean the significant difference of seed germination percentage and seed infection rate among five samples respectively at P<0.05 (Duncan).

2.1　種樣發芽率與帶菌率

從圖1看出，不同收獲年份的老芒麥發芽率不同。總體來看，種樣發芽率介于56%～80%，其中種樣S2發芽率最高，達到80%，顯著高于S1和S5(P<0.05)；種樣S2、S3與S4之間發芽率差異不顯著(P>0.05)。老芒麥種樣帶菌率隨著儲藏時間的增加呈下降趨勢，帶菌率介于24%～38%。其中，種樣S5帶菌率最高，達到38%，顯著高于其他種樣(P<0.05)；種樣S1、S2與S3之間帶菌率差異不顯著(P>0.05)。

2.2　種帶真菌種類及分離率

經分離培養，共鑒定出老芒麥種帶真菌15屬17種(表1)，另有3種真菌分離物未能得到鑒定。各種真菌的平均分離率介于0.25%～8.75%，平均為1.61%。其中，分離率大于1%的有12種，按分離率由高到低依次為青霉(8.75%)、曲霉(4.50%)、細交鏈孢(3.75%)、叢梗孢(2.75%)、串珠鐮孢(2.63%)、德氏霉(2.00%)、鐮孢菌1(1.38%)、皮思霉(1.25%)、單格孢(1.25%)、燕麥鐮孢(1.13%)、離蠕孢(1.13%)、鏈二孢(1.13%)。在5個種樣中均分離到的真菌有2種，分別是青霉和曲霉(表1)。

2.3　種帶真菌對老芒麥種子發芽率的影響

與對照相比，供試的12種種帶真菌對老芒麥種子的發芽率產生了不同程度的影響(圖2)。根據其對種子發芽率的影響程度，可歸為3類: 1)燕麥鐮孢、鐮孢菌1和串珠鐮孢3種鐮孢菌極顯著地降低了種子的發芽率，分別達到14.5%，26.5%和31.3%(P<0.01)；2)離蠕孢、德氏霉、單格孢、鏈二孢、皮思霉5種真菌較強地抑制了老芒麥種子的萌發(P<0.05)；3)曲霉、細交鏈孢、青霉、叢梗孢4種真菌對種子的發芽率沒有明顯作用(P>0.05)。

表1　老芒麥種樣種帶真菌種類及分離率

注：同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05，Duncan)。

Note：Different small letters indicate the significant difference among five samples atP<0.05 (Duncan).

2.4　種帶真菌對老芒麥種子發芽勢的影響

發芽勢是反映種子發芽整齊度的指標，其數值越大，表示種子萌發越集中，反之則越分散。從結果可以看出(圖3)，不同種帶真菌對老芒麥種子的發芽勢影響不同。燕麥鐮孢、串珠鐮孢和鐮孢菌1等3種真菌極顯著地降低了種子的發芽勢(P<0.01)；離蠕孢、德氏霉、單格孢、鏈二孢、皮思霉、青霉、細交鏈孢、叢梗孢8種真菌顯著地降低了老芒麥種子的發芽勢(P<0.05)；曲霉對種子發芽勢沒有顯著抑制作用(P>0.05)。

2.5　種帶真菌對老芒麥種子平均發芽時間的影響

活力較高的種子具有發芽整齊、出苗快的特點，反之則差異性明顯。從結果可以看出(圖4)，不同真菌對老芒麥種子的平均發芽時間影響不同。皮思霉、離蠕孢、曲霉3種真菌顯著延長了老芒麥種子平均萌發時間(P<0.05)；相反，燕麥鐮孢顯著地縮短了種子平均發芽時間(P<0.05)。其他真菌對老芒麥種子的平均發芽時間沒有顯著影響(P>0.05)。

2.6　種帶真菌對老芒麥幼苗生長的影響

從圖5看出，接種真菌對老芒麥幼苗的生長產生了不同程度的影響。與對照相比，供試的12種種帶真菌均顯著地降低了老芒麥芽長(P<0.05)。3種鐮孢菌(燕麥鐮孢、串珠鐮孢和尖鐮孢)對苗長的抑制作用最為明顯，接種后老芒麥苗長分別只有0.51，0.62和1.14 cm；其次細交鏈孢、離蠕孢、叢梗孢、鏈二孢和德氏霉5種真菌較強地抑制了幼苗的生長；曲霉、青霉、皮思霉、單格孢對幼苗生長的影響較弱。除曲霉對老芒麥根長無顯著影響外，其他真菌均顯著地抑制了老芒麥幼根的生長(P<0.05)。燕麥鐮孢和串珠鐮孢對根長的抑制作用最為顯著，接種后根長分別為0.53和0.57 cm；尖鐮孢、細交鏈孢、離蠕孢、鏈二孢、單格孢對老芒麥幼苗的根長也有較強的抑制作用；德氏霉、青霉、叢梗孢、皮思霉4種真菌對老芒麥根長的影響較弱。

圖2　真菌對老芒麥種子發芽率的影響Fig.2　Percentage of seed germination of E. sibiricus after inoculation with various seed-borne fungi 　　　A:對照Control； B：細交鏈孢Alternaria alternata； C：曲霉Aspergillus sp.； D：鏈二孢Biospora sp.； E：離蠕孢Bipolaris sp.； F：德氏霉Drechslera sp.； G：燕麥鐮孢Fusarium avenaceum； H：串珠鐮孢F. monilifome； I：鐮孢菌1 Fusarium sp.1； G：叢梗孢Monilia sp.； K：青霉Pecinillium sp.； L：皮思霉Pithmyces sp.； M：單格孢Ulocladium sp.；不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著，*表示在P<0.01水平差異顯著Different letters and * indicate significant difference at 0.05 level and 0.01 level with Duncan’s multiple range tests, respectively.下同The same below.

2.7　種帶真菌對老芒麥幼苗干重的影響

由圖6可以看出，除曲霉外，其他供試種帶真菌均不同程度地降低了老芒麥幼苗的干重。其中，燕麥鐮孢、串珠鐮孢、鐮孢菌1、細交鏈孢極顯著地降低了幼苗的干重(P<0.01)；鏈二孢、離蠕孢、德氏霉、叢梗孢、青霉、皮思霉、單格孢7種真菌顯著降低了老芒麥幼苗的干重(P<0.05)。

3討論

種子休眠是導致種子發芽率降低的重要原因，隨著儲存時間的增加，種子的休眠會逐漸被解除[23]。本試驗所試的5種老芒麥種樣中，種樣S5儲藏時間最短， 發芽率最低，顯著低于其他種樣，可能是由于種子收獲時間不長，大多數種子還處于種子休眠狀態所致[24-25]。另外，在自然狀態下，隨著儲藏年限的增加，種子活力不斷下降，發芽率也會逐漸下降[26]。在本試驗中，種樣 S2、S3和S4發芽率差異不顯著，表明隨著儲藏年限增加種子發芽率并未顯著降低，可能是由于老芒麥種子在低溫條件下能持久保持活力，種子的發芽率還未呈現明顯的下降趨勢[27]。與之相比，種樣帶菌率隨著儲藏年限呈現下降的趨勢，這與李春杰等[10]在紫花苜蓿的研究結果類似。究其原因，一方面可能是由于剛成熟的種子攜帶著大量的真菌(既通過母體植株垂直傳播而來，也通過周圍環境水平傳播獲得)。隨著儲藏年限的增加，種子種帶真菌區系不斷發生變化，一些不能適應儲藏環境的種帶真菌逐漸被淘汰。另一方面，Meyer等[28]研究表明真菌侵染速率與種子的萌發速率呈負相關。剛收獲的種子由于大部分處于休眠狀態不能萌發，給真菌的大量繁殖創造了條件，因此更容易被分離。而隨著儲藏時間的延長，老芒麥種子休眠不斷被解除，種子通過快速萌發可以規避真菌的侵染[29]。

圖3　真菌對老芒麥種子發芽勢的影響Fig.3　Seed germination potential of E. sibiricus after inoculation with various seed-borne fungi

圖4　真菌對老芒麥種子平均發芽時間的影響Fig.4　Seed mean germination time of E. sibiricus after inoculation with various seed-borne fungi

通過分離培養，本試驗從5個老芒麥種樣中共檢測出15屬17種種帶真菌，另有3種白色絲狀真菌未產孢，未能鑒定(表1)。其中青霉和曲霉兩種真菌是老芒麥種子最常見的種帶真菌，在5個種樣中均被分離得到，這與李春杰和南志標[13]在苜蓿種子上的研究結果相類似。在對分離率高于1%的12種種帶真菌進行致病性研究后發現，燕麥鐮孢、串珠鐮孢、鐮孢菌1、離蠕孢和德氏霉5種真菌是老芒麥最主要的致病真菌，均顯著地降低了老芒麥種子的萌發、抑制了幼苗的生長、降低了幼苗的生物量。細交鏈孢盡管對種子的萌發沒有顯著抑制作用(圖2)，但是對幼苗的生長產生了較強的抑制作用，顯著降低了老芒麥苗長和根長，以及干物質產量(圖5和圖6)，這與楊顏霞等[22]在結縷草(Zoysiajaponica)種子上研究結果相一致。

圖5　真菌對老芒麥幼苗生長的影響Fig.5　Shoot and root length of E. sibiricus after inoculation with various seed-borne fungi

圖6　真菌對老芒麥幼苗干重的影響Fig.6　Seedling dry weight of E. sibiricus after inoculation with various seed-borne fungi

種子平均發芽時間是其固有的一種特性，但是在受到不同程度的脅迫后可能被延長或者縮短。如阮松林和薛慶中[30]研究發現高鹽脅迫可延緩水稻(Oryzasativa)種子萌發時間，而顏宏等[31]研究發現不同鹽溶液處理縮短了向日葵(Helianthusannuus)種子的萌發時間。究其原因，可能是不同植物種子對鹽脅迫的響應機制不同，需要更深入的研究。在本研究中，種帶真菌對老芒麥種子的萌發時間表現不一，這與楊顏霞等[22]在結縷草種子上的研究結果相類似。

種帶真菌在種子中的存在部位是病害發生的先決條件，幾乎決定了病害發生的強度[32]。陳林[33]在紅豆草(Onobrychisviciaefolia)種子外部組織(莢皮和種皮)中檢測到27種真菌，而在內部組織(胚和胚乳)中僅檢測出10種真菌。然而，張穎[34]研究發現，多年生黑麥草(Loliumperenne)種帶真菌主要存在于胚乳，其次為稃殼，甚少存在于胚中。究其原因，一方面可能是由于不同物種間病原真菌侵染種子的能力不同，即種子形態差異對真菌侵染阻力不一，另一方面氣候條件等因素差異也會影響病原真菌對種子的侵染[35]。本研究只對帶有稃片的老芒麥種子進行了種帶真菌檢測，關于其種帶真菌的存在部位有必要進行更深入的研究。

溫度和濕度對種帶病害的發生和發展有著極為重要的影響[10]。因此，老芒麥種子應選擇在天氣晴朗時快速收獲，及時曬干，且儲藏時注意通風透氣，從而降低病原真菌對種子的侵染。另外，種子播種時用殺菌劑拌種可防止病害在田間傳播與流行[36]，從而改進草地建植，提高草地的生產力[37]。甲基托布津是一種廣譜內吸性殺菌劑，對細交鏈孢等多種種帶病原真菌有較好的抑制效果[38]。例如，南志標[14]對沙打旺(Astragalusadsurgens)種帶真菌的研究發現，甲基托布津處理種子后細交鏈孢的檢出率降低了46.1%。Buchenauer[39]研究發現三唑酮對串珠鐮孢有很好的抑制效果。而且，Papavizas和Lewis[40]研究發現兩種或多種殺菌劑混合使用效果優于單一殺菌劑。本研究發現鐮孢菌對老芒麥種子萌發和幼苗生長的影響最為嚴重，而細交鏈孢也顯著地降低了幼苗的生物量。因此，采用甲基托布津和三唑酮混合拌種也許能降低老芒麥種帶病害的發生，然而其能否有效抑制老芒麥種帶病害則需要更深入的研究。

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Seed-borne fungi infection of Siberian wildrye: Effects on seed germination and seedling growth

CHEN Tao, NAN Zhibiao*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Abstract:We investigated seed-borne fungi in Siberian wildrye seed samples collected from Qinghai in five different harvest seasons (S1to S5) and tested the effects of fungal infection on seed germination and seedling growth. Seed germination ranged from 56%to 80%. S2had the highest seed germination (80%), significantly higher than S1and S5(P<0.05).The fungal infection rate of seed samples varied from 24% to 38% and declined with the extension of storage time.S5had the highest infection rate of 38%, significantly higher than all other samples (P<0.05).17 fungal species from 15 genera were identified; the isolation rate ranged from 0.25% to 8.75%. Penicillium sp. and Aspergillus sp. were the most common seed-borne species found and were isolated in all seasons. Pathogenicity tests showed that Fusarium avenaceum，F. monilifome，Fusarium sp.1，Drechslera sp. and Bipolaris sp. were the most pathogenic fungi, significantly reducing seed germination and seedling growth (P<0.05). Alternaria alternata significantly reduced seedling growth but did not affect seed germination. Pithomyces sp.，Aspergillus sp. and Bipolaris sp. significantly prolonged the mean seed germination period, while Fusarium avenaceum significantly shortened it (P<0.05).

Key words:Siberian wildrye (Elymus sibiricus)；germination；seed-borne fungi；pathogenicity

*通訊作者

Corresponding author. E-mail：zhibiao@lzu.edu.cn

作者簡介：陳燾(1989-)，男，甘肅會寧人，在讀博士。E-mail：chent2007@lzu.edu.cn

基金項目：國家“973”項目(2014CB138702)資助。

*收稿日期：2013-09-03；改回日期：2014-05-12

DOI：10.11686/cyxb20150212

http://cyxb.lzu.edu.cn

陳燾， 南志標. 不同儲存年限老芒麥種子種帶真菌檢測及致病性測定. 草業學報， 2015， 24(2)： 96-103.

Chen T, Nan Z B. Seed-borne fungi infection of Siberian wildrye: Effects on seed germination and seedling growth. Acta Prataculturae Sinica， 2015， 24(2)： 96-103.