雷公藤甲素體內代謝產物研究*

★　劉建群　王雪梅　張國華　舒積成　張銳　(江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室　南昌 330004)

雷公藤甲素體內代謝產物研究*

★劉建群*第一作者：劉建群(1970—)，男，博士，教授。研究方向：中藥活性成分及質量評價。Tel: (0791)87119027，E-mail: liu5308@sina.com。王雪梅張國華舒積成張銳(江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室南昌 330004)

摘要：目的：研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠體內的代謝產物，為闡明甘草對雷公藤的減毒增效機制以及指導雷公藤甲素代謝產物的分離鑒定奠定基礎。方法：采用高效液相色譜二極管陣列結合電噴霧離子肼多級質譜(HPLC-DAD-ESI/Trap/MSn)法研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠尿液中的代謝產物。結果：在大鼠尿液中發現雷公藤甲素代謝產物4個，分子量分別為376(M1)，376(M2)，374(M3)和390(M4)。根據DAD紫外光譜圖、電噴霧離子肼多級質譜以及藥物體內代謝特點初步鑒定為：2(或5)-羥基雷公藤甲素(M1，M2)，2-羰基雷公藤甲素(M3)，2-羰基-5-羥基雷公藤甲素(M4)。結論：氧化代謝產物為雷公藤甲素的主要代謝產物，氧化代謝可能為雷公藤甲素的解毒途徑。

關鍵詞：雷公藤甲素；甘草；代謝產物；HPLC-MSn

雷公藤甲素(triptolide)是從衛矛科雷公藤屬植物雷公藤中分離出來的環氧二萜內酯化合物，是雷公藤的主要活性成分，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤和抗生育等活性，但同時也是其毒性成分，具有肝臟、腎、心臟和生殖系統等多臟器毒性[1]。文獻[2-6]報道甘草與雷公藤配伍能顯著降低雷公藤的毒性，但其減毒機制尚不明確。甘草具有肝藥酶誘導作用，與其它藥物聯用后，可能改變藥物代謝行為，從而影響藥物毒性[7]。目前報道的雷公藤甲素代謝產物較少，主要有單羥基化代謝產物、環氧化物水解開環代謝產物及谷胱甘肽結合物[8-9]。筆者前期采用LC-MS/MS法從雷公藤甲素單獨給藥和與甘草聯合給藥的大鼠尿液中發現代謝產物5個(分子量376, 358, 358, 358, 374)[10]。本文首次采用高效液相色譜二極管陣列結合電噴霧離子肼多級質譜進一步研究了雷公藤甲素在大鼠尿液中的代謝產物。結果發現代謝產物4個(分子量376，376，374，390)，其中分子量390代謝物為首次報道。首次分析了代謝產物的電噴霧離子肼多級質譜裂解途徑，并初步推斷了代謝位點和代謝產物結構。研究結果表明，氧化代謝產物為雷公藤甲素的主要代謝產物，氧化代謝可能為雷公藤甲素的解毒途徑。

1材料

1.1儀器與試藥Agilent1100LC-MSD-Trap型液質聯用儀(四元泵，柱溫箱，DAD檢測器，美國Agilent公司)；十萬分之一分析天平(AE-240，瑞士梅特勒)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；R-201旋轉蒸發儀(廈門精藝興業科技有限公司)；雷公藤甲素對照品(購自南京澤朗醫藥科技有限公司，含量≥98%，批號分別為ZL111119)；甘草(購自江西藥都樟樹中藥飲片有限公司，產地內蒙，品種為GlycyrrhizauralensisFish.，批號12020101)；甲醇、乙腈(色譜純，美國默克公司)；二氯甲烷、丙酮、石油醚、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；0.9%的氯化鈉注射液(江西科倫藥業有限公司，批號為H10983064)。

1.2動物SD大鼠，體重200～220g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2011-0003)。

2方法

2.1溶液配制甘草溶液的制備：準確稱取甘草藥材800g，切片，加4倍量水煎煮1 h 2次，過濾，合并濾液，減壓蒸干，得甘草浸膏約80g，用適量蒸餾水配制成甘草溶液。

雷公藤甲素注射液的制備：精密稱取雷公藤甲素對照品38.7mg，置100mL容量瓶中，用20%丙二醇生理鹽水溶液溶解并稀釋至刻度。

Kedde's試劑的配制：2%的3,5-二硝基苯甲酸乙醇液與1mol/L的KOH水溶液以1∶1體積比混合，現配現用。

2.2給藥與尿液收集健康SD大鼠80只，每天灌胃給予甘草水煎劑(生藥量30g/kg)，2 h后腹腔注射給予雷公藤甲素溶液(0.7mg/kg劑量)，放入代謝籠中，自由飲水，連續收集9h尿液。連續給藥甘草15 kg及雷公藤甲素350mg，將收集到的尿液合并，減壓濃縮后用甲醇溶解保存。

2.4尿液代謝產物的提取和處理將尿液甲醇溶液過濾，去除蛋白，減壓蒸干得浸膏。將浸膏用水溶解，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取。減壓回收溶劑得乙酸乙酯部位浸膏3.2 g，正丁醇部位浸膏16.8 g。經TLC檢測(Kedde's試劑顯色)，結果顯示雷公藤二萜內酯類代謝產物主要在乙酸乙酯部位和正丁醇部位。將乙酸乙酯部位的浸膏3.2 g，用甲醇溶解后，經凝膠柱色譜(SephadexLH-20)分離，以甲醇洗脫，每份收集5 mL，得52個流分。經TLC檢測，Kedde's試劑顯色，合并具有Kedde's試劑顯色反應的流份(含雷公藤二萜內酯類代謝產物)，減壓蒸干，用10mL甲醇溶解，得代謝產物提取液，作為供試品溶液。

2.5HPLC-DAD-ESI/Trap/MSn測定代謝產物

2.5.1色譜條件Dikma C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫， 0min(10%A)→60min(90%A)；流速1mL/min，DAD-ESI/Trap/MSn檢測；柱溫為30℃，進樣量為10μL。

2.5.2ESI-Trap-MSn測定條件離子源溫度325 ℃，毛細管電壓3.5 kV，霧化壓力14.99psi，干燥氮氣流速4.99 L/min，質譜掃描范圍m/z 50～800，正離子模式。

圖1　雷公藤甲素代謝產物提取物的HPLC圖

圖2　雷公藤甲素M0

3結果與討論

雷公藤甲素代謝產物提取物的HPLC圖見圖1，DAD紫外光譜圖見圖2。根據HPLC-DAD紫外光譜圖，從中發現4個色譜峰(M1-M4，保留時間分別為： 15.348、16.285、29.261和41.662min)的紫外光譜圖與藥物原型雷公滕甲素相似，而甘草空白尿液中缺失，初步判斷這4個色譜峰可能為雷公滕甲素的代謝產物。代謝產物M1-M4的ESI/Trap/MSn圖見圖3-6。

圖3　雷公藤甲素代謝產物M1的ESI/Trap/MSn圖

圖4　雷公藤甲素代謝產物M2的ESI/Trap/MSn圖

圖5　雷公藤甲素代謝產物M3的ESI/Trap/MSn圖

圖6　雷公藤甲素代謝產物M4的ESI/Trap/MSn圖

M1的準分子離子有[M+NH4]+m/z 394和[M+H]+m/z 377，[M+H]+m/z 377的可能裂解過程為(見圖7)：[M+H]+m/z 377發生取代基斷裂連續失去H2O形成離子峰m/z 359、m/z 341。m/z 359再失去3H2O形成離子峰m/z 305。m/z 341繼續失去CH2CHCH3、HCHO、CO、CH4等中性分子形成離子峰m/z 299、m/z 269、m/z 223、m/z 325。m/z 325發生7(8)和9(10)位開環形成離子峰m/z 177。m/z 341發生9(11)和13(14)位開環形成離子峰m/z 229、m/z 113。M1的主要碎片離子均得到較合理解析。根據可能代謝途徑、分子量以及質譜裂解途徑推測M1可能為雷公藤甲素單羥基化產物。據文獻報道[11]雙鍵有活化烯丙位代謝作用，烯丙位為代謝活性位點，因此推測M1可能為2(或5)-羥基雷公藤甲素。

圖7　雷公藤甲素代謝產物M1的質譜可能裂解途徑

圖8　雷公藤甲素代謝產物M2的質譜可能裂解途徑

M2的準分子離子[M+H]+ m/z377的可能裂解過程與M1相似，主要發生失去H2O、CH3CH2CH3、HCHO、CO等中性分子以及開環(見圖8)。M2的分子量與M1同樣為376，可能為雷公藤甲素的另一單羥基化產物。根據可能代謝途徑、分子量以及質譜裂解途徑推測M2為2(或5)-羥基雷公藤甲素。

M3的準分子離子[M+H]+m/z 375的可能裂解過程與M1和M2相似(見圖9)。M3的分子量為374，比M1和M2少2個質量數。烯丙位羥基較容易進一步代謝氧化為羰基，因此M3可能為M1或M2的羥基進一步被氧化成羰基產物。根據可能代謝途徑、分子量以及質譜裂解途徑，結合烯丙位為代謝活性位點，推測M3為2-羰基雷公藤甲素。

圖9　雷公藤甲素代謝產物M3的質譜可能裂解途徑

M4的準分子離子[M+H]+m/z 390的可能裂解過程與其他代謝物相似(見圖10)。M4的分子量為390，比M3多16個質量數，可能為M3的另一烯丙位進一步被羥基化形成。根據可能代謝途徑、分子量以及質譜裂解途徑，結合烯丙位為代謝活性位點，推測M4為2-羰基-5-羥基雷公藤甲素。分子量為390的雷公藤甲素代謝物為首次報道。

圖10　雷公藤甲素代謝產物M4的質譜可能裂解途徑

4結論

本文首次采用高效液相色譜二極管陣列結合電噴霧離子肼多級質譜法研究了配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠尿液中的代謝產物。發現代謝產物4個，其中單羥基化代謝物2個，羰基化代謝物1個，羥基及羰基化代謝物1個。分子量分別為376，376，374和390，其中分子量390代謝物為首次報道。根據DAD紫外光譜圖、電噴霧離子肼多級質譜以及藥物體內代謝特點初步鑒定為：2(或5)-羥基雷公藤甲素，2-羰基雷公藤甲素，2-羰基-5-羥基雷公藤甲素。并首次分析了代謝物的電噴霧離子肼質譜裂解途徑。研究結果表明：氧化代謝產物為雷公藤甲素的主要代謝產物，氧化代謝可能為雷公藤甲素的解毒途徑。

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征稿啟事

《江西中醫藥》所設的重點欄目有《明醫心鑒》、《滕王閣醫話》等。《明醫心鑒》以介紹名老中醫經驗和中醫臨證心得為主，重點刊載中醫關于疑難病的診療經驗，要求觀點、方法新，經驗獨到。《滕王閣醫話》主要反映中醫教學、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強，富于知識性、趣味性。

Identification of Metabolites from Triptolide in Vivo

LIU Jian-qun, WANG Xue-mei, ZHANG Guo-hua, SHU Ji-cheng, ZHANG Rui

KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China.

Abstract:Objective: To identify the metabolites of triptolide combined with Glycyrrhiza uralensis in vivo and disclose the attenuation mechanism of Glycyrrhiza uralensis on Tripterygium wilfordii. Methods: The SD rats were injected with triptolide after orally taken with extracts of Glycyrrhiza uralensis. The metabolites of triptolide in rat urine were identified by HPLC-DAD-ESI/Trap/MSnmethod. Results: Four metabolites (molecular weight of 376, 376, 374, 390 ) of triptolide in rat urine were found and initially identified as 2(5)-OH- triptolide(M1，M2), 2-oxo-triptolide(M3), 2-oxo-5-OH-triptolide(M4), respectively. Conclusion: The metabolite (M4) is reported for the first time. The main metabolites of triptolide are oxidates.

Key words:Triptolide; Glycyrrhiza uralensis; Metabolic Products; HPLC-MSn

收稿日期：(2014-06-23)編輯：曾文雪

中圖分類號：R96

文獻標識碼：A

基金項目：*國家自然科學 (81160541)；江西省衛生廳中醫藥科研計劃項目(2011A143)。