覆盆子活性成分山奈酚的含量測定*

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覆盆子活性成分山奈酚的含量測定*

★謝一輝1*第一作者：謝一輝(1958—),男，教授，碩士生導師。研究方向：中藥活性成分分析。E-mail:243619851@qq.com。丁妍華1練波1余斌2樊浩1*通信作者：樊浩(1980—)男，副教授，博士。研究方向：中藥現代鑒定技術、生物傳感器。E-mail:105095500@qq.com。(1.江西中醫藥大學南昌 330004；2.江西省化學工業學校南昌 330012)

摘要：目的：建立覆盆子改善腎陽虛型癡呆活性成分山奈酚的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相：乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長 266nm，進樣量20μL。結果:山奈酚質量在0.0782～5.000μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.50%，RSD=2.1%。 結論:試驗方法簡便、快速、實驗結果準確可靠，該方法可作為覆盆子有效成分山奈酚含量測定的方法。

關鍵詞：覆盆子；高效液相色譜法；山奈酚；老年癡呆

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果實。性微溫、味甘、酸，歸肝、腎經，具補肝益腎、固精縮尿、明目之功效，許多抗衰古方中含有覆盆子。據現代藥理研究，覆盆子具有改善學習記憶能力、延緩衰老[1]、抗誘變[2]、促進淋巴細胞增殖、溫腎助陽等作用，其含有多種抗氧化、調節免疫功能和調整物質代謝等作用的成分[3]。

課題組前期研究表明：覆盆子以及覆盆子有效組分可顯著地改善腎陽虛型癡呆大鼠在morris水迷宮中的定位航行與空間探索能力，有效地保護腎陽虛癡呆動物的海馬CA1區神經元使其免受損傷，明顯減少細胞tau蛋白異常表達[4]，起到改善腎陽虛型癡呆大鼠學習記憶能力[5-6]，改善腎陽虛型癡呆等功效較為顯著。研究表明覆盆子有效成分為乙酸乙酯部位中黃酮類成分，而山奈酚是覆盆子黃酮中含量最高、活性最強的活性成分[7]。從覆盆子中提取的單體成分進行神經細胞保護實驗顯示，山奈酚顯著性保護神經細胞免受H2O2的損傷，而且在所有單體成分中活性最高。后期將進行覆盆子活性成分防治老年腎陽虛型癡呆的作用機制和組分配伍研究。為保證后續研究的實驗結果真實、可靠、穩定，必須要求覆盆子藥材所含量成分，特別是最主要的活性成分山奈酚含量穩定。有必要建立覆盆子活性成分山奈酚的含量測定方法。對覆盆子質量進行科學準確評價，有利于后續對覆盆子進行深入研究，也有利于臨床用藥的安全有效。

1儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀；Sartorius BS214-D天平(萬分之一)；Mettler AE240天平(十萬分之一)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；GZX-9146MBE型數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；自動三重蒸餾水器(上海亞榮生化儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；RE-52旋轉蒸發儀(上海青浦滬西儀器廠)；Du-650紫外可見光譜儀(美國貝克曼公司)。

山奈酚對照品(自提，PHLC歸一化純度為：99.59%)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。覆盆子藥材購于樟樹、九江、湖南等地，經劉慶華老師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果實。

2方法與結果

2.1色譜條件及系統適應性試驗色譜柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長 266nm，進樣量：20μL。在上述色譜條件下，理論塔板數按山奈酚計算不低6 000, 山奈酚與相鄰組分峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1-2。

圖1　覆盆子樣品HPLC圖

圖2　山奈酚對照品HPLC圖

2.2對照品溶液的制備稱取山奈酚對照品約10mg，精密稱定。置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液，并稀釋至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL。

2.3供試品溶液的制備精密稱取覆盆子粉末約2g，精密稱定。加甲醇60mL于水浴回流1h,放冷至室溫，濾過，濾液于蒸發皿中蒸干，精密加入甲醇2mL, 稱重，水浴加熱使殘渣溶解，放冷，加甲醇補足重量，即得。

2.4線性關系的考察取上述對照品液，配制成9個不同濃度的山奈酚對照品液，含量分別是：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91 μg/mL。取上述對照品液各20μL，按2.1色譜條件測定各對照液的峰面積。以對照品重量為橫坐標，其色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，得到山奈酚回歸方程式為：Y=2618.05X-50.625，r=0.9999，結果表明山奈酚在0.0782～5.000μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗精密吸取同一對照品溶液，按2.1色譜條件測定，每次進樣20μL，連續進樣6針，測定山奈酚峰面積值，峰面積RSD為1.7%，表明儀器精密度良好。

2.6重復性試驗取覆盆子粉末6份，每份約2g，精密稱定。按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定。結果顯示：山奈酚平均含量約為20μg/g，RSD值為0.86%(n=6)，表明該法重復性好。

2.7穩定性試驗取供試品品溶液，常溫放置，分別于0,2,4,8,12,24h，按2.1色譜條件測定，記錄色譜峰面積，計算出山奈酚的含量，RSD=2.3%，表明供試品溶液中山奈酚在24h內保持穩定。

表1　加樣回收試驗結果

2.1%(n=9)，結果見表1。

2.9樣品含量測定取5個產地的了覆盆子藥材細粉各約2 g，精密稱定。按2.3條件制備供試溶液, 按2.1條色譜條件進樣分析, 計算山奈酚的含量, 結果見表2。

表2　不同產地覆盆子的含量測定結果

3討論

3.1檢測波長的選擇取山奈酚對照品溶液在190～500nm范圍內進行紫外波長掃描，山奈酚在266nm處有最大吸收，故選266nm作為檢測波長。

3.2流動相考察比較了不同酸堿性的流動相，結果顯示采用酸性流動相, 可有效提高柱效, 改善峰形，減少山奈酚的色譜峰拖尾現象, 而其中以0.1%磷酸水溶液的分離效果最佳。比較了不同配比和不同酸度的甲醇水、甲醇酸水、乙腈水和乙腈酸水，結果顯示乙腈∶0.1%磷酸= 30∶70所組成的流動相分離效果最佳。

3.3供試品溶液制備方法的選擇考察了甲醇超聲、索氏提取、乙醇回流和甲醇回流4種提取方法，結果表明甲醇回流山奈酚含量最高，雜質峰相對較少。曾試用硅膠柱、反相填料柱、聚酰胺柱、硅藻土的預處理甲醇回流液，以除去提取液的雜質，因經上述處理后，山奈酚易損失，故直接將回流液濃縮定容后測定。

參考文獻

[1]李天傲,譚喜瑩.HPLC測定覆盆子中沒食子酸含量[J].中國現代應用藥學,2008,25(3)；235-237.

[2]付德潤,鐘承民,郭偉,等.覆盆子抗誘變作用的實驗研究[J].中國全科醫學雜志,1998 ,1 (1) :35.

[3]佟麗華.覆盆子的化學成份研究[J].佳木斯醫學院學報，1994，17 (2)：51.

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[5]黃麗萍,熊玉潔,趙夢嵐,等.覆盆子有效部位改善腎陽虛型癡呆大鼠學習記憶作用機制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(19)：192-196.

[6]黃麗萍,熊玉潔,趙夢嵐,等.覆盆子對腎陽虛型DA大鼠學習記憶的影響[J].中藥藥理與臨床,2013，29(4)：111-113.

[7]黃麗萍,熊玉潔,趙夢嵐,等.覆盆子不同萃取部位對東莨菪堿所致學習記憶障礙大鼠的影響[J].時珍國醫國藥,2013,24(9)：

2 083-2 084.

Quantitative Determination of Active Ingredient Kaempferol inRubusChingiiHu

XIE Yi-hui1,DING Yan-hua1,LIAN Bo1,YU Bin2,FAN Hao1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiChemicalIndustrySchool，Nanchang330012,China.

Abstract:Objective: To establish method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu. Methods: Using high performance liquid chromatography. The column was Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm),mobile phase: acetonitrile-0.1% phosphoric acid in water (30∶70),flow rate: 1mL/min, column temperature:30℃, detection wavelength:266nm, the injection volume:20μL.Results: The quality of Kaempferol ranged from 0.0782μg to 5.000μg. Peak area showed a good linear relationship (r=0.9999) and the average sample recovery rate was 99.50%, RSD=2.1%.Conclusion: The method is simple, rapid and accurate, which can be used as an effective method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu.

Key words:Rubus Chingii Hu；PHLC；Kaempferol；Senile Dementia

收稿日期：(2014-11-10)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

基金項目：*江西省自然科學 (20142BAB205025)；江西中醫藥大學“道地藥材及特色中藥資源研究專項”。