姜黃素眼用脂質體的角膜透過性研究*

姜黃素眼用脂質體的角膜透過性研究*

摘要：目的：研究姜黃素眼用脂質體的角膜透過性。方法：采用乙醇注入法制備姜黃素脂質體，以三甲基殼聚糖對脂質體囊泡進行包覆；采用過膜法、粒徑及電位測定儀對脂質體進行理化性質分析；采用離體兔角膜透過實驗及共聚焦激光掃描顯微鏡成像技術，對三甲基殼聚糖包覆的脂質體的角膜透過作用進行研究。結果：三甲基殼聚糖對脂質體的包覆對脂質體的包封率無明顯影響，但粒徑、電位有所增大，同時角膜透過顯著高于未包覆脂質體組，隨著作用時間的延長，可促進脂質體囊泡滲透至角膜上皮深層60 μm處，并主要以細胞旁路途徑發生角膜透過。結論：該研究表明三甲基殼聚糖對脂質體囊泡具有明顯的角膜促透作用。

關鍵詞：三甲基殼聚糖；姜黃素；角膜透過；共聚焦激光掃描顯微鏡成像

白內障是世界首位致盲因素，也是我國第一位的致盲眼病。研究表明自由基及其相關的氧化應激是導致晶狀體生理功能改變、最終導致白內障的關鍵步驟[1]。姜黃素(Curcumin，縮寫為Cur)為姜黃中提取的有效成分，具有抑制脂質過氧化、清除羥自由基、增強抗氧化物酶活性，抑制誘導性氧化氮合酶(iNOS)的活性。通過大鼠硒性白內障動物模型的建立，本課題組發現，姜黃素脂質體可改善晶狀體的生化指標，抑制硒性白內障導致的晶狀體氧化過程[2]。

然而角膜上皮層的緊密連接可封閉細胞頂部的細胞間隙，阻擋細胞外的大分子物質經細胞間隙進入組織，是眼用藥物生物利用度極低的主要原因之一[3]。研究表明殼聚糖可通過打開細胞上皮層緊密連接，從而促進藥物的腸吸收[4]，然而眼部生理環境下，殼聚糖分子無法以離子狀態存在、水溶性變差，因此本文以自制三甲基殼聚糖為脂質體囊泡的包覆材料，以期荷正電性更高、水溶性更強的三甲基殼聚糖可對難溶性藥物姜黃素的角膜透過性起到促進作用。

1材料與試藥

1.1材料天然蛋黃卵磷脂(PC-98T，上海艾韋特醫藥科技有限公司，批號EL11005)；高純膽固醇(上海艾韋特醫藥科技有限公司，批號A90719)；氧化型谷胱甘肽(北京Solarbio公司，批號G8690)；三甲基殼聚糖(Trimethyl chitosan chloride，TMC，自制，季銨化37.5%)；其他試劑均為分析純。

1.2試藥姜黃素(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3動物日本大耳兔(普通級，南昌龍平兔業有限公司，許可證號：SCXK(贛)2009-0001。

2方法與結果

2.1姜黃素包覆脂質體的制備采用乙醇注入法制備姜黃素未包覆脂質體(Cur-loaded liposomes，簡寫為Cur-L)，稱取處方量Cur、天然蛋黃卵磷脂、高純度膽固醇溶于2 mL乙醇(姜黃素為1.41 mg、4%磷脂濃度、膽固醇：磷脂質量比為1∶5.44)，磁力攪拌下將制備的類脂溶液緩慢勻速注入10 mL水溶液中(50 °C)，保持該溫度下除去乙醇，超聲均化(100 W，3 min)，得到透明乳光混懸液。

配制1%的TMC的水溶液，注入到同等體積的Cur-L中，在4 ℃條件下磁力攪拌30 min，即得三甲基殼聚糖包覆Cur脂質體(TMC-coated Cur-loaded liposomes，簡寫為TMC-Cur-L)。

2.2色譜條件色譜柱為phenomenex luna C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動相為乙腈：0.2 %乙酸=58∶42；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 °C；檢測波長為426 nm；進樣量為20 μL。按上述色譜條件，以樣品的色譜峰峰面積(A)對Cur濃度(C，μg/mL)進行線性回歸，得到標準曲線方程為A=174.17C-62.873(r=0.9999)?？梢娫谠撋V條件下，Cur在該濃度范圍內，色譜峰峰面積(A)與濃度(C)呈良好的線性關系。

2.3理化性質測定采用過膜法[5]測量姜黃素脂質體的包封率。采用0.22 μm水系濾膜，精密吸取過膜前后脂質體，無水乙醇破乳，各取20 μL進樣，測定包含脂質體中總藥物峰面積和過膜后除去游離藥物的脂質體的峰面積。包封率測定公式：

包封率(%)=過膜后的藥物峰面積/過膜前藥物總峰面積×100。

取脂質體混懸液適量，稀釋至適當倍數，用粒徑及ζ電位測定儀測定脂質體的粒徑大小和Zeta電位。

姜黃素脂質體的理化性質測定結果見表1。

制劑包封率/%粒徑/nmZeta電位/mVCur-L94.5±0.2104.1±1.91.75±0.1TMC-Cur-L92.3±0.4147.5±2.313.2±0.1

2.4眼部刺激性實驗取健康家兔4只，左眼結膜囊內滴入0.1 mL生理鹽水為對照，右眼結膜囊內滴入0.1 mL Cur-L及TMC-Cur-L，滴眼后輕輕閉合眼瞼約10 s，分別于點藥后1，24，48，72 h對眼部進行檢查[6]。根據國家食品藥品監督管理局2005年《眼刺激反應分值標準》評分記錄，結果顯示與對照組相比，給藥組角膜透明，虹膜清晰，結膜未充血，無水腫及分泌物，手電配備放大鏡檢查角膜病變，評分均為0。

2.5擴散介質的配制新鮮配制谷胱甘肽-碳酸氫鈉林格溶液的配制：一部分含氯化鈉12.400 g/L，氯化鉀0.716 g/L，磷酸二氫鈉0.206 g/L，碳酸氫鈉4.908 g/L；另一部分含五水氯化鎂0.318 g/L，二水氯化鈣0.230 g/L，葡萄糖1.800 g/L，氧化型谷胱甘肽0.184 g/L，低溫儲存，用前等量混合。

2.6離體兔角膜的制備耳緣靜脈注射空氣處死家兔，用鑷子剪斷動眼肌及視神經叢，摘除眼球，沖去表面附著的血塊，置于34 °C預熱的林格溶液中。由視神經叢向前剖開眼球，剝離眼球后部組織，撕去虹膜得到帶有2 mm鞏膜環的角膜。操作過程盡量避免接觸角膜以防造成角膜表面損傷。處死動物后20 min內開始體外角膜透過實驗[7]。

離體兔角膜透過實驗步驟：采用改良Franz擴散池。將新鮮離體兔角膜保持角膜彎曲形狀，固定在供給池和接受池之間(角膜有效擴散面積為0.5 cm2)，使上皮層面向供給池。在供給池中加入0.5 mL待測制劑，在接受池中加入5 mL新鮮配制的林格溶液。

2.7共聚焦激光掃描顯微鏡成像在設定時間點60min、150min時沖洗供給池和接受池除去多余的熒光溶液，取出角膜，濾紙吸干角膜表面后置于共聚焦激光成像儀(ZEISS LSM 710，德國蔡司公司)的載物臺上，進行CLSM成像分析。檢測條件：物鏡放大倍數×63，HeNe激光源的激發波長為激發波長485nm，發射波長538nm。油鏡觀察，每幀0.44 μm，進行3D成像。結果見圖1-2。

(A) Cur-L/60min; (B) Cur-L/150min;

由圖1可見，當作用時間為60 min時，Cur-L組熒光幾乎無法檢測，而TMC-Cur-L組可滲透至40 μm深度，隨著作用時間的延長，與角膜作用150 min后，Cur-L可滲透至角膜上皮層10 μm處，然而TMC-Cur-L的角膜滲透性增強、信號強度增大至角膜上皮層60 μm處仍可檢測到熒光信號。

圖2　TMC-Cur-L組兔角膜橫截面截圖

由上述結果可知，TMC-Cur-L組對姜黃素的角膜透過作用顯著，針對TMC-Cur-L，當作用時間為150 min時，沿Y軸方向，水平掃描角膜上皮層。從角膜表面開始，每0.44 μm深度掃描一次，CLSM成像結果如圖2所示。由圖2可見，TMC-Cur-L與離體角膜相互作用后，熒光信號主要分布在細胞周圍，只有少數在胞漿中，說明TMC-Cur-L主要通過細胞旁路途徑透過角膜。

2.8角膜水化值的測定角膜水化值是體外評價角膜刺激性的重要指標。正常角膜水化值為76 %～80 %。將新取角膜及上述體外角膜透過實驗結束后的角膜(僅留暴露于擴散介質的角膜區域)稱重，記為Wa；經70 °C干燥12 h后稱重，記為Wb。角膜水化值(H %)由下列公式計算求得，結果見表2。

樣品水化值/%新鮮角膜77.4±0.4Cur-L78.3±0.9TMC-Cur-L81.7±1.2

3討論與結論

三甲基殼聚糖作為殼聚糖的衍生物，水溶性增強、荷正電性提高，由于角膜與腸道黏膜結構類似，因此認為自制三甲基殼聚糖可以類似殼聚糖促藥物腸吸收的機制，達到促藥物角膜透過的目的。研究表明，在腸道殼聚糖通過C-2上的正電氨基與細胞膜和緊密連接處的負電位點相互作用，從而打開緊密連接[8-9]。因此分析TMC可以上述相同或相似的機制打開角膜上皮細胞間的緊密連接促進脂質體經細胞旁路透過角膜。

參考文獻

[1]Resnikoff S, Pascolini D, Etya'ale D, et al. Global data on visual impairment in the year 2002[J].Bull World Health Organ, 2004, 82:844-851.

[2]倪斌, 李翔, 羅云, 等. 黃素眼用脂質體的制備及晶狀體抗氧化作用考察[J].中國實驗方劑學雜志, 2014, 20 (6): 5-9.

[3]Yavuz B, Pehlivan SB, ünlü N. Dendrimeric systems and their applications in ocular drug delivery[J].Scientific World J, 2013: 732 340.

[4]Shrestha N, Shahbazi MA, Araújo F, et al. Chitosan-modified porous silicon microparticles for enhanced permeability of insulin across intestinal cell monolayers[J].Biomaterials, 2014, 35 (25): 7 172-7 179.

[5]任瑾, 方正杰, 印曉星, 等. 槲皮素前體脂質體的質量考察[J].中國現代應用藥學, 2013, 30 (1): 39.

[6]化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則. 國家食品藥品監督管理局藥品注冊管理方法文件. 2005: 14-16.

[7]李德馨.抗白內障前藥雙硫侖經眼給藥傳遞系統及作用機制[D].沈陽藥科大學, 2005.

[8]Schipper NG, Olsson S, Hoogstraate JA, et al. Chitosan as absorption enhancers for poorly absorbable drugs 2: mechanism of absorption enhancement[J].Pharm Res, 1997, 14: 923-929.

[9]van der Lubben IM, Verhoef JC, Borchard G, et al. Chitosan and its derivatives in mucosal drug and vaccine delivery[J].Eur J Pharm Sci, 2001, 14: 201-207.

The Effect of N-trimethyl Chitosan as Coating Materials on Corneal Permeability of Curcumin

ZHANG Jing1, LI Xiang2, LUO Yun1, LIANG Xin-li1, LIAO Zheng-gen1

1.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.

Abstract:Objective: To study the effect of N-trimethyl chitosan as coating materials on corneal permeability of curcumin. Methods: Curcumin-loaded liposomes were prepared by ethanol injection method, and the vesicles were coated with trimethyl chitosan. Membrane filter, dynamic light scattering and electrophoretic light scattering were employed to study the physicochemical parameters. Corneal permeability of trimethyl chitosan-coated liposomes was carried out by transcorneal permeation study and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results: It was shown that the entrapment efficiency was not changed significantly with enlarged size and zeta potential with the coating of TMC. The TMC-coated liposomes produced the more pronounced corneal permeation, compared with the uncoated preparations. With the increased contact time, the fluorescence in rabbit corneal epithelium can be detected down to 60 μm below the surface via paracellular route. Conclusion: TMC has significant effect on the transport of curcumin through rabbit cornea in vitro.

Key words:N-trimethyl Chitosan; Curcumin; Corneal Permeability; Confocal Laser Scanning Microscopy

收稿日期：(2014-06-27)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

基金項目：*國家自然科學 (81202927)；江西省教育廳青年 (GJJ12535、GJJ12536)；江西省衛生廳中醫藥科研計劃項目(2012A160、2012A157)；江西省青年科學基金項目(20122BAB215018、20132BAB215022、20114BAB215038)；江西省科技支撐計劃項目(20123BBG70181)。

通信作者：★張婧1李翔2羅云1梁新麗1廖正根1*廖正根，博士，教授。研究方向：中藥新劑型與新技術。Tel：(0791)87119190，E-mail:lyzlyg@163.com。(1.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室南昌 330004；2.江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心南昌 330006)