身痛逐瘀湯對大鼠神經病理性疼痛及脊髓p38 MAPK蛋白表達的影響*

★　王志福第一作者：王志福(980—)，男，博士，講師。研究方向：疼痛的中西醫結合基礎與臨床。E-mail:wzf9900@6.com。　俞向梅　龔德貴　林心君　王彥青　吳根誠　(.福建中醫藥大學中西醫結合學院　福州 50；.福建中醫藥大學附屬康復醫院　福州 50；.復旦大學上海醫學院中西醫結合系　上海 000)

身痛逐瘀湯對大鼠神經病理性疼痛及脊髓p38 MAPK蛋白表達的影響*

★王志福1*第一作者：王志福(1980—)，男，博士，講師。研究方向：疼痛的中西醫結合基礎與臨床。E-mail:wzf993002@163.com。俞向梅1龔德貴2林心君1王彥青3吳根誠3(1.福建中醫藥大學中西醫結合學院福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院福州 350122；3.復旦大學上海醫學院中西醫結合系上海 230002)

摘要：目的：觀察中藥復方身痛逐瘀湯對CCI大鼠神經病理性疼痛及脊髓p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)蛋白的影響。方法：SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、身痛逐瘀湯單倍劑量組(6.5g/kg) 、身痛逐瘀湯雙倍劑量組(13 g/kg)。假手術組切開暴露坐骨神經而不結扎，模型組結扎坐骨神經誘導神經痛模型，術后未給予干預治療。給藥組在造模后第3天開始灌胃給藥，在造模后第3，5，7，14d觀察大鼠熱痛閾、機械痛閾、運動評分值的變化，免疫熒光檢測CCI大鼠小膠質細胞活化情況，Western-Blot檢測大鼠脊髓p38蛋白表達變化。結果：在造模后第7d和第14d，與假手術組相比，模型組大鼠熱痛閾值、機械痛閾值出現顯著降低，右側后肢運動功能評分顯著升高(P<0.01)，小膠質細胞標記物OX-42免疫陽性物質表達顯著增多；與模型組相比，身痛逐瘀湯給藥組均可顯著提高熱痛、機械痛閾值(P<0.05；P<0.01)，并降低右側后肢運動評分值(P<0.01)。與假手術組相比，模型組大鼠在造模后第7d和第14d脊髓磷酸化p38蛋白(p-p38)表達顯著上調(P<0.01)；與模型組相比，身痛逐瘀湯給藥組在造模后第14d可顯著下調脊髓p-p38蛋白的表達(P<0.01)。結論：中藥復方身痛逐瘀湯可抑制CCI大鼠的痛敏反應，改善患側后肢運動功能，其機制可能與下調脊髓磷酸化p38蛋白表達，降低脊髓神經炎癥反應有關。

關鍵詞：身痛逐瘀湯；神經痛；p38MAPK

神經病理性疼痛(Neuropathic Pain，簡稱神經痛)是由神經系統原發性損害和功能障礙所激發或引起的疼痛。本課題組前期研究表明，在神經痛的發生發展過程中，脊髓中樞出現敏化現象，可表現為膠質細胞活化及炎性細胞因子釋放。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路是細胞內應激反應信號通路，與炎癥和疼痛發生密切相關[1-4]。有研究表明，脊髓磷酸化p38蛋白主要存在于小膠質細胞中，并在神經痛發生中發揮重要作用，應用磷酸化p38蛋白抑制劑可顯著減輕神經痛的痛敏反應[5]。身痛逐瘀湯作為經典方劑之一，基于中醫理論“不通則痛”治療痹證，臨床治療效果明確。本文以身痛逐瘀湯為研究藥物，通過坐骨神經慢性壓迫性損傷(Chronic Constriction injury ，CCI)制備經典神經痛模型，觀察身痛逐瘀湯對神經痛大鼠痛行為學、運動功能及脊髓p38蛋白變化的影響，為今后臨床應用治療提供理論依據。

1實驗材料

1.1動物清潔級雄性SD大鼠，體重200～220g，購于上海西普爾-必凱實驗動物中心。許可證號SCXK(滬)2008-0016。

1.2受試藥物身痛逐瘀湯處方藥材購于福建中醫藥大學附屬國醫堂醫院門診部，經鑒定符合2010年版《中國藥典》相應標準。藥方組成及劑量依據《方劑學》(鄧中甲主編，2010年第二版，中國中醫藥出版社)制備，詳細如下：桃仁9g，紅花9g，當歸9g，川芎9g，沒藥6g，五靈脂6g，秦艽3g，羌活3g，地龍6g，香附3g，牛膝6g，甘草6g。中藥浸泡2h，先加入12倍量水，煎煮40min后過濾藥渣，再加8倍量水煎煮40min后過濾，兩次濾液合并，濃縮后4℃保存。根據實驗大鼠和人的體表面積比例系數換算，確定大鼠原方單倍給藥劑量為6.5g/kg，雙倍給藥劑量為13g/kg，每日灌胃給藥1次。模型組以等劑量溶液的蒸餾水灌胃。

1.3試劑和儀器p38、GAPDH抗體購于美國Abcam公司；OX-42免疫熒光試劑盒(上海碧云天試劑公司)；336型輻射熱測痛儀(美國);Reichert-Jung恒冷切片機(德國);垂直電泳槽(上海天能科技有限公司);SYNGENE生物圖像系統(美國);biotek酶標儀(美國);UITRA TURRAX勻漿儀(美國);Heraeus離心機(上海納锘實業有限公司);倒置顯微鏡(日本)。

2實驗方法

2.1CCI模型建立健康雄性清潔級SD大鼠60只，體重(200±20)g，飼養于12h光照、12h黑暗的環境中，自由攝食和飲水。對動物的處理嚴格遵守有關國際實驗動物使用準則，應用隨機數字表將SD大鼠分為假手術組(Sham)、模型組(CCI)、身痛逐瘀湯單倍劑量組(6.5g/kg)、身痛逐瘀湯雙倍劑量組(13g/kg)，每組各15只。每組實驗動物中，10只用于痛行為學及運動功能評價，5只用于分子指標檢測。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(按4mL/kg注射)后，右側后肢皮膚切開，肌肉鈍性分離，暴露坐骨神經，在坐骨神經中段用4-0鉻制羊腸線松扎四道，建立CCI神經痛大鼠模型，術后青霉素粉末預防感染。該實驗模型建立條件成熟，可重復性好，已被國內外實驗研究廣泛應用[1-2]。假手術組只暴露坐骨神經不結扎，其他手術操作如模型組。給藥組在造模后第3天開始灌胃給藥，每日1次，持續至第14天，痛行為學及運動功能評分測定在造模后第3，5，7，14d進行，實驗取材在造模后第7d及第14d進行。

2.2痛行為測定根據前期的研究方法[1-4]，機械痛采用Von-Frey法進行檢測，即利用不同強度的纖毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠縮爪反應。最小能引起縮爪反應的纖毛壓力即為大鼠的縮爪反應閾值，以此反應大鼠的機械痛敏情況，纖毛刺激克數包括1.4，2，4，6，8，10，15 g。熱痛采用輻射熱測痛儀測定，大鼠放入玻璃格子中自由活動，靜置20 min后，輻射熱強光照射大鼠足掌，測定大鼠的縮爪潛伏期(Paw Withdrawal Latency，PWL)。測定時，每只大鼠左右足掌交替測定，每次間隔不低于1 min，大鼠PWL基本穩定后取后3次測定結果的平均值作為基礎值(Baseline)。測定時熱源強度維持在恒定水平，使基礎痛閾控制在8～12s左右。為防止大鼠熱輻射燙傷，將PWL的上限值(cut-off time)定為20s。

2.3運動功能評分參照Hwang方法[6]，分別觀察實驗前及第3，5，7，14d中藥治療后大鼠右側后肢的運動情況。將運動功能共分為4級：0分沒有運動改變，正常行走；1分輕度運動功能減弱，對足底的刺激縮爪反應正常：2分自主活動減弱，中度運動功能減弱，正常行走，對足底的刺激有縮爪反應，但減弱；3分不能自主活動。

2.4分子指標檢測各組大鼠在實驗結束后，用腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)麻醉后，一部分大鼠迅速取出脊髓節段L4-5背角置于液氮中，最后儲存于-70℃保存待測；另一部分大鼠灌流固定后取脊髓L4-5節段，并進行冰凍切片后保存。Western Blot檢測脊髓L4-5節段背角p38蛋白表達變化，免疫熒光檢測脊髓OX-42免疫陽性物質表達變化，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書規范操作。

3結果

3.1身痛逐瘀湯對CCI大鼠熱痛、機械痛閾值的影響CCI大鼠造模術后第3，5，7，14d，與假手術組相比，右側后肢足底熱痛、機械痛閾值均顯著降低。單倍與雙倍劑量中藥復方身痛逐瘀湯灌服從術后第3天開始，灌胃至術后第7，14d后，與模型組相比，右側后肢足底熱痛、機械痛閾值均顯著提高；單倍與雙倍劑量組相比，二者未見顯著性差異，見圖1-2。

圖1　各組機械痛閾值變化

注：與假手術組相比，1)P<0.01；與模型組相比，2)P<0.05，3)P<0.01。

圖2　各組熱痛閾值變化

注：與假手術組相比，1)P<0.01；與模型組相比，2)P<0.05，3)P<0.01。

圖3　各組大鼠右后肢運動功能分值變化

注：與假手術組相比，1)P<0.01；與模型組相比，2)P<0.01。

3.2身痛逐瘀湯對CCI大鼠患側后肢運動功能的影響CCI大鼠造模術后第7，14d，與假手術組相比，右側后肢運動功能評分值顯著升高，后肢運動功能明顯減弱。單倍與雙倍劑量中藥復方身痛逐瘀湯灌服從術后第3d開始，灌胃至術后第14d后，與模型組相比，右側后肢運動功能評分值均顯著下降；單倍與雙倍劑量組相比，二者未見顯著性差異，見圖3。

3.3身痛逐瘀湯對CCI大鼠脊髓OX-42免疫陽性物質表達的影響 CCI大鼠造模術后第7，14d，與假手術組(Sham)相比，脊髓背角OX-42免疫陽性物質表達大量增加。單倍與雙倍劑量中藥復方身痛逐瘀湯灌服從術后第3d開始，灌胃至術后第14d后，與模型組(術后第7，14d)相比，二者均可明顯降低脊髓背角OX-42免疫陽性物質的表達數量。

3.4身痛逐瘀湯對CCI大鼠脊髓p38蛋白表達的影響CCI大鼠造模術后第7，14d，與假手術組(Sham)相比，脊髓背角磷酸化p38蛋白表達顯著增加。單倍與雙倍劑量中藥復方身痛逐瘀湯灌服從術后第3d開始，灌胃至術后第14d，與模型組(術后第14d)相比，二者均可明顯降低脊髓背角磷酸化p38蛋白表達。單倍與雙倍劑量組相比，二者未見顯著性差異，見圖4。

圖4　各組大鼠脊髓p38蛋白表達情況

注：與假手術組相比，1)P<0.01，2)P<0.01；與模型組相比，3)P<0.01，4)P<0.01。

4討論

身痛逐瘀湯出自《醫林改錯》卷下，具有活血祛瘀，祛風除濕，通痹止痛之功效，在實驗性癌痛、炎性痛中發揮顯著的抗炎鎮痛作用[7-8]。CCI誘導神經痛大鼠模型，在一定程度上模擬臨床干性坐骨神經痛情況。坐骨神經痛屬中醫“痹證”范疇，根據王清任“痹證有瘀血說”，基于“活血通痹”方法治療各種痹證，臨床鎮痛效果顯著[9-11]。本實驗應用經典方劑身痛逐瘀湯觀察其對CCI大鼠的鎮痛作用，研究結果表明，CCI誘發神經痛時，大鼠足底出現顯著的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏，右側后肢運動功能顯著減弱。神經痛發生發展過程中，脊髓背角小膠質細胞活化明顯，表現為脊髓OX-42免疫陽性物質表達增加，脊髓磷酸化p38蛋白表達顯著上調。應用不同劑量身痛逐瘀湯灌胃治療，二者均可明顯提高熱痛閾值和機械痛閾值，減輕痛敏反應，并顯著改善神經損傷誘發的運動功能。此外，身痛逐瘀湯可顯著抑制表達上調的脊髓OX-42免疫陽性物質及磷酸化p38蛋白。而關于身痛逐瘀湯如何抑制p38蛋白磷酸化，減輕中樞敏化現象，是否可通過調節周圍神經-免疫功能，發揮中樞及外周抗炎鎮痛效應，有待于今后深入研究探討。

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Effects of Shentong Zhuyu Decoction on Neuropathic Pain and the p38 MAPK Protein Expression in Spinal Cord in Rats

WANG Zhi-fu1, YU Xiang-mei1, GONG De-gui2, LIN Xin-jun1, WANG Yan-qing3, WU Gen-cheng3

1.IntegrativeMedicineCollege,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM)，Fuzhou350122，China;

2.FujianUniversityofTCMSubsidiaryRehabilitationHospital，Fuzhou350122，China;

3.DepartmentofIntegrativeMedicineandNeurobiology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai, 230002，China.

Abstract:Objective: To investigate the analgesic effect of Shentong zhuyu decoction in neuropathic pain and the effect on the expression of p38 Mitogen-activated protein kinase in CCI rats. Method: SD rats were randomLy divided into Sham operation group(Sham)，Chronic constrictive injury group(CCI), Shentong zhuyu group(6.5 g/kg) and Shentong zhuyu group(13 g/kg). Paw withdrawal latency(PWL) , mechanical withdrawal threshold(MWT), Sports score values, activation of microglial cell, spinal phosphorylation protein of p38 was tested respectively 3，5，7，14 day afer CCI surgery.Result: The result showed that Shentong zhuyu decoction had significantly enhanced the values of PWLand MWT, and inhibited the upregulation of spinal p38 phosphorylation protein.Conclusion: Shentong zhuyu decoction could inhibit the pain hyperalgesia, improve the motor function of right hind limb. The mechanism of analgesic effect might be associated with the downgulation of p38 protein.

Key words:Shentong Zhuyu decoction；neuropathic pain；p38MAPK

收稿日期：(2014-10-30)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

基金項目：*國家自然科學 (81072875)。