hFcεRIα／RBL-2H3細胞株的構建與評價

王南南，劉中成，張艷芬，劉玉欣，崔 哲，陳 瑤

（河北大學1．藥學院、2．科學技術處，河北保定 071002）

hFcεRIα／RBL-2H3細胞株的構建與評價

王南南1，劉中成1，張艷芬2，劉玉欣1，崔 哲1，陳 瑤1

（河北大學1．藥學院、2．科學技術處，河北保定 071002）

中國圖書分類號：R329．24；R392．11；R394.2；R593.1

摘要：目的 構建穩定表達人FcεRIα（hFcεRIα）亞基的RBL-2H3細胞株。方法 利用RT-PCR技術克隆hFcεRIα基因，構建真核表達載體pCI-neo-hFcεRIα。脂質體介導法轉染RBL-2H3細胞，G418篩選獲得穩定轉染細胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫熒光法鑒定轉染結果。結果通過對脂質體介導轉染體系進行優化，轉染效率可高達75.38%。經Western blot、免疫熒光及RT-PCR鑒定，hFcεRIα基因在RBL-2H3細胞內成功表達。結論 成功構建hFcεRIα／RBL-2H3細胞模型，為深入研究IgE與FcεRI作用機制及相關藥物開發提供了實驗基礎。

關鍵詞：hFcεRIα；IgE；RBL-2H3細胞；脂質體轉染；G418篩選；穩定細胞株

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．032．html

隨著工業發展、環境污染加重以及人們生活方式現代化，變態反應性疾病發病率呈逐年增加的趨勢，已經成為一種常見病和流行病，尚未有肯定的治愈方法［1］。世界衛生組織（WHO）將變態反應性疾病列為21世紀重點研究和防治的三大疾病之一，已受到諸多研究者的廣泛關注［2］。肥大細胞、嗜堿性粒細胞等效應細胞表面FcεRI與IgE結合是觸發變態反應的關鍵，以IgE／FcεRI信號通路為靶點進行藥物設計已成為當前治療變態反應性疾病藥物研究的熱點［3－4］。

大鼠嗜堿性白血病細胞（rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）是大鼠嗜堿粒細胞腫瘤株的一個亞系，細胞膜表達IgE高親和力受體FcεRI，具有肥大細胞的多種生物學特性，是實驗室中常用的一種早期、穩定且敏感的肥大細胞脫顆粒體外檢測模型［5－13］。由于人肥大細胞不易獲得且培養條件要求嚴格，RBL-2H3細胞一直是研究變態反應發病機制及治療方法的模式材料［6－8］。據文獻報道，人IgE具有高度的種屬特異性，人IgE僅與人FcεRI結合，而不與嚙齒類動物體內FcεRI作用，因此，以RBL-2H3細胞為基礎進行體外人IgE與FcεRI的作用研究及藥物設計具有一定的局限性。本研究利用基因工程技術克隆hFcεRIα基因，通過構建pCI-neo-hFcεRIα真核表達載體，建立了穩定表達hFcεRIα的RBL-2H3細胞。該重組細胞模型將為深入研究變態反應發病機制及藥物開發提供條件基礎。

1　材料與方法

1．1材料 RBL-2H3大鼠嗜堿性白血病細胞購自中國科學院細胞庫；pCI-neo載體、DH5α菌株由本實驗室保存；限制性內切酶Xba I、EcoR I、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、兔抗人FcεRIα抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTD、PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、逆轉錄試劑盒、FITC標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗兔IgG購自康為世紀生物科技有限公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、G418購自索來寶生物科技有限公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；GeneTran III轉染試劑購自Bi-omiga；PCR引物等DNA均由生工生物工程有限公司合成。

1．2人FcεRIα基因的克隆 依據GenBank公布的hFcεRIα基因組序列及表達載體pCI-neo多克隆酶切位點設計引物序列如下：上游引物：5′-GGAATTCGAAGAAGATG-GCTCCTGC-3′（25 bp），下劃線部分表示EcoR I限制性內切酶識別位點；下游引物：5′-GCTCTAGATCAGTTGTTTTT-GGGGT TTG-3′（28 bp），下劃線部分表示Xba I限制性內切酶識別位點。U937細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養液中，當細胞匯合度達90%時提取細胞總RNA，RT-PCR法克隆hFcεRIα基因，按以下反應程序擴增目的基因：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環；72℃，2 min。純化回收目的片段。

1．3pCI-neo-hFcεRIα表達載體的構建與鑒定 取質粒載體pCI-neo和回收的hFcεRIα目的片段，分別用Xba I和EcoR I限制性內切酶于37℃雙酶切1 h，然后酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化，再在T4連接酶的作用下于16℃連接過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，涂于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB固體培養基，置于37℃生化培養箱中培養12～16 h。挑取單克隆菌落進行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB液體培養基中，37℃震蕩培養過夜。質粒試劑盒提取重組質粒，將Xba I和EcoR I雙酶切鑒定正確的菌液送生工生物工程有限公司測序。將測序結果通過blast比對，完全正確的質粒命名為pCI-neo-hFcεRIα。無內毒素試劑盒大量提取質粒并定量備用。

1．4pCI-neo-hFcεRIα轉染RBL-2H3細胞及轉染條件的優化

1．4．1脂質體轉染步驟 RBL-2H3細胞，用含10%新生牛血清的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，用0.25%的胰酶消化細胞傳代，每2 d換液，3～4 d傳代1次，收集對數生長期的細胞進行實驗。轉染前1 d RBL-2H3細胞均勻鋪于24孔板，2×105個每孔。細胞匯合度達90%～95%時，按Biomiga說明書分別轉染pCI-neo-hFcεRIα 和pCI-neo：分別將適量質粒DNA和脂質體加入無抗生素、無血清的DMEM培養液50 μL中混勻，靜置5 min。然后將兩溶液混勻，室溫放置20 min。吸棄培養板中的培養液，PBS清洗2遍，加入無血清、無抗生素的培養液200 μL，培養箱中孵育20 min。將轉染混合液逐滴加入培養板，輕輕混勻，置于培養箱中孵育。

1．4．2細胞接種數目的優化 轉染前1 d分別接種不同數目的細胞于24孔板：2×105、1×105、5×104個每孔，每組重復3次。24 h后觀察細胞匯合度，通過免疫熒光結合細胞計數法檢測轉染效率。

1．4．3質粒與轉染試劑比例的優化 確定合適的培養條件及細胞接種數目后，按照說明書確定加入質粒的量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg，質粒加入量與轉染試劑量的比例依次設定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行轉染。24 h后，免疫熒光結合細胞計數法計算細胞轉染效率。

1．5穩定轉染細胞株的篩選 RBL-2H3細胞培養于含10%新生牛血清的DMEM完全培養液中，均勻鋪于24孔板，1 000個細胞每孔。待細胞匯合度達50%時，向每孔中加入G418至終濃度分別為：0、300、400、500、600、700、800、 900 mg·L－1，每個濃度設3個復孔。培養2～3 d更換培養液，并保持G418濃度不變，培養10～14 d。選取RBL-2H3細胞全部死亡的最低G418濃度為最佳細胞篩選濃度。

細胞轉染24 h后，按1∶10傳代至含新鮮完全培養液的6孔板，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。24 h后用最佳細胞篩選濃度的G418進行篩選，每3 d更換含G418的培養液，至未轉染組細胞全部死亡。采用有限稀釋法將轉染組細胞接種于96孔板，培養2～3 d后，觀察細胞生長情況，標記生長有單克隆細胞的孔繼續G418加壓培養，停止板內生長多個克隆和無細胞生長的孔培養。3～4 d更換含G418的培養液，孔內單克隆密度達1／3時，消化細胞單克隆，逐級擴大培養至獲得穩定的單克隆細胞系，同時以半G418濃度維持篩選。

1．6hFcεRIα／RBL-2H3細胞的鑒定 RT-PCR檢測：利用試劑盒提取轉染后細胞總RNA，RT-PCR法檢測目的基因的表達。所用內參照為β-actin，上游引物為5′-CTCCATCCTG-GCCTCGCTGT-3′（20 bp），下游引物5′-GCTGTCACCTTCAC-CGTTCC-3′（20 bp），PCR產物應為308 bp。按以下反應程序進行擴增：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環；72℃，2 min。反應結果進行瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照。

Western blot檢測：轉染24 h后，收集轉染細胞，提取細胞膜蛋白，Western blot檢測目的基因的表達。首先將膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜。再加與封閉液1∶500稀釋的兔抗人FcεRIα抗體，37℃孵育1h，TBST洗2次，加入1∶2 000稀釋后的HRP-標記的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗2次，加入ECL發光液，檢測結果并拍照。以β-actin作為內參。

免疫熒光檢測：取轉染細胞與野生型RBL-2H3細胞接種于24孔板，每毫升4×105個，培養箱中培養過夜。PBS 洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，5%BSA封閉1 h。與1∶500兔抗人FcεRIα多克隆抗體孵育過夜，PBS洗3次，再與FITC標記羊抗兔IgG孵育2 h，PBS洗3次后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2　結果

2．1hFcεRIα基因的克隆 提取U937細胞總RNA（Fig 1A），利用RT-PCR方法克隆得到了hFcεRIα基因（796 bp）（Fig 1B）。測序后與GenBank：J03605．1提供序列相一致，表明成功克隆hFcεRIα基因。

2．2pCI-neo-hFcεRIα表達載體的構建與鑒定 hFcεRIα重組質粒通過Xba I和EcoR I雙酶切及PCR鑒定，電泳得到796 bp目的條帶，與預期結果相符（Fig 2），表明成功構建pCI-neo-hFcεRIα表達載體。

2．3轉染條件的優化

2．3．1細胞接種數目的確定 分別接種細胞2×105、1× 105、5×104個每孔于24孔板，含10%新生牛血清的無雙抗培養液培養。24 h后顯微鏡下觀察，發現每組匯合度依次為90%～100%、75%～85%、60%～70%；3組細胞按照說明書進行轉染，結果發現細胞匯合度對轉染效率影響較大，且匯合度達75%～85%時的細胞轉染效率較佳，轉染效率可達70.23%（Fig 3）。

Fig 1 Analysis of total RNA from U937 and product of RT-PCR by agarose gel electrophoresis

Fig 2 Recombinant plasmid pCI-neo-hFcεRIα digested with Xba I and EcoR I

Fig 3 Effect of cell confluence on transfection efficiency

2．3．2質粒用量及質粒與轉染試劑比例的確定 接種細胞1×105個每孔，含10%新生牛血清的無雙抗培養液培養，細胞匯合度達75%～85%時進行轉染。分析發現當DNA加入量小于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多，轉染效率也隨之增高；當DNA加入量大于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多轉染效率下降。當質粒加入量為3.0 μg、質粒與轉染試劑比例為1∶3時轉染效率最高，可達75.38%（Fig 4）。

Fig 4 Effect of DNA and transfection reagent on transfection efficiency

2．4G418最佳篩選濃度的確定 不同濃度的G418處理細胞，每隔2 d換1次液，且顯微鏡下觀察細胞生長狀況。開始時各組細胞均生長旺盛、狀態良好；G418篩選3 d后，800、900 mg·L－1孔中部分細胞出現死亡，對照組細胞匯合度達90%；加壓篩選6 d后，800、900 mg·L－1孔中細胞全部死亡，600、700 mg·L－1孔中部分細胞出現死亡，細胞狀態差；加壓篩選9 d后，700 mg·L－1孔中細胞全部死亡，600 mg·L－1孔中僅少數細胞貼壁存活；加壓篩選12 d后，600 mg·L－1孔中細胞全部死亡，其余G418濃度孔內細胞僅部分死亡。因此，G418最佳篩選濃度為600 mg·L－1，見Fig 5。將重組質粒轉染細胞、空載質粒轉染細胞及野生型RBL-2H3細胞用含有終濃度為600 mg·L－1G418的培養液加壓篩選，至野生型RBL-2H3細胞全部死亡而轉染細胞克隆貼壁生長；改用含300 mg·L－1G418的培養液維持篩選3～5代至轉染細胞能穩定生長，繼續傳代并冷凍保存。

Fig 5 Conditions of RBL-2H3 cells treated with 600 mg·L－1G418 at different time

2．5hFcεRIα／RBL-2H3細胞鑒定

2．5．1RT-PCR鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細胞中的表達情況 細胞轉染24 h后，提取細胞總RNA，利用RT-PCR方法檢測目的基因的表達。結果如Fig 6所示，轉染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細胞中hFcεRIα得到了表達，轉染pCI-neo及未轉染的RBL-2H3細胞中未檢測到相應mRNA存在，內參β-actin在3種細胞內均正常表達。

Fig 6 hFcεRIα expressed in RBL-2H3 by RT-PCR analysis

2．5．2Western blot鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細胞中的表達情況 細胞轉染24 h后，提取細胞膜蛋白，利用Western blot檢測目的基因的表達。結果表明，轉染pCI-neo-hFcεRIα 的RBL-2H3細胞中hFcεRIα表達，而在轉染pCI-neo及未轉染的RBL-2H3細胞均無hFcεRIα表達（Fig 7）。

Fig 7 Expression of hFcεRIα in RBL-2H3 by Western blot

2．5．3免疫熒光法檢測hFcεRIα蛋白的表達 細胞轉染24 h后，利用免疫熒光法檢測目的基因的表達。結果表明，轉染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結果呈陽性，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光（Fig 8），而轉染pCI-neo及未轉染的RBL-2H3細胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結果呈陰性，熒光顯微鏡下無綠色熒光。

3　討論

肥大細胞是IgE介導的I型變態反應的主要效應細胞，RBL-2H3細胞系是大鼠嗜堿性粒細胞系的一個亞系，可以表達肥大細胞的許多特性和功能，常作為過敏反應性疾病體外研究的替代模型。由于IgE與其高親和受體FcεRI的作用具有種屬特異性，故以RBL-2H3細胞為模型研究I型變態反應具有一定的局限性。因此，構建人源化的RBL-2H3細胞株是便于研究I型變態反應機制及治療方法的重要手段之一。

Fig 8 Immunofluorescence assay of transfected RBL-2H3 cells

肥大細胞表面IgE高親和力受體FcεRI由4個亞基組成：1個α鏈、1個跨4次膜的β鏈及2個通過二硫鍵連接的γ鏈。研究者對此3種亞基在變態反應中的作用進行了大量研究，發現在人FcεRIα（hFcεRIα）轉染的嚙齒動物細胞中，當hFcεRIα與嚙齒類FcεRI中γ共表達時，hFcεRIα的胞外區會高效表達［14－16］。本實驗通過RT-PCR法得到人FcεRIα基因并將其克隆入真核表達載體pCI-neo，利用脂質體轉染法將重組質粒導入RBL-2H3細胞，成功構建了hFcεRI／RBL-2H3細胞株，RT-PCR、Western blot以及免疫熒光結果均表明hFcεRIα在轉染細胞內成功表達［17－20］。

脂質體介導法是當前常用的轉染方法，但不同細胞及不同載體的轉染條件各不相同。本實驗通過對轉染條件進行優化，發現在轉染過程中細胞生長狀態及匯合度是影響轉染效率的重要因素，待轉染細胞處于對數期、匯合度達75%～85%時，轉染效率最高可達70.23%。不同細胞的轉染條件有很大的差異，卓長華等［21］在轉染AAV-293細胞時發現，待細胞匯合度達60%～80%時細胞轉染效率較佳；張歡等［22］選用匯合度達80%～90%的HEK293細胞進行轉染；張椿等［23］則待H292細胞匯合度達90%～95%時進行轉染。本研究采用Biomiga公司的GeneTran III high efficiency transfec-tion reagent作為轉染試劑，該產品推薦轉染細胞的匯合度為90%～95%，在實驗過程中發現按照此操作得到的結果不理想，分析原因可能是該細胞匯合度過高致細胞活性下降、細胞活力降低，從而導致該細胞轉染效率降低，這一點可以進一步通過該細胞EB染色及MTT、CCK實驗進行驗證。此外，本實驗優化了DNA和轉染試劑的用量及比例，發現在一定范圍內加大DNA及脂質體的用量會提高轉染效率，分析認為細胞處于一定的匯合度時，DNA及脂質體相對不足；當脂質體過量時，其對細胞的毒性作用增大，從而導致轉染效率降低。Karmali等［24］亦有類似的研究。

細胞穩定轉染最常用的篩選方法是G418篩選，在篩選前需要確定G418的最佳篩選濃度。眾所周知，不同細胞對G418的敏感性不同，而同一細胞由于不同廠家、甚至同一廠家生產的相同濃度的G418的批次不同，其活性亦不盡相同，故即使是同一細胞，其最佳G418篩選濃度也有可能不同。Takagi等［17］建立穩定轉染的RBL-2H3細胞株時使用500 mg ·L－1的G418進行篩選；Taudou等［18］用含1 000～2 000 mg ·L－1的選擇性培養基篩選轉染的RBL-2H3細胞；Zhang等［25］則在研究RBL-2H3細胞內Syt2的表達及作用時選用終濃度為800 mg·L－1的G418篩選穩定轉染的RBL-2H3細胞。本實驗通過對RBL-2H3細胞的最佳篩選濃度進行摸索，最終確定600 mg·L－1的G418為最佳篩選濃度。

綜上所述，本實驗成功構建了真核表達載體pCI-neo-hFcεRIα，建立了最佳RBL-2H3細胞轉染及篩選體系，獲得了穩定表達hFcεRIα的RBL-2H3細胞株，為基于RBL-2H3細胞模型研究變態反應奠定了基礎。

（致謝：本研究于河北大學藥學院藥物質量分析控制重點實驗室完成。）

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◇研究簡報◇

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［24］Karmali P P，Majeti B K，Sreedhar B，et al．In vitro gene transfer efficacies and serum compatibility profiles of novel mono-，di-，and tri-histidinylated cationic transfection lipids：a structure-activity in-vestigation［J］．Bioconjug Chem，2006，17（1）：159－71．

［25］Zhang J C，Lu W L，Li Y R，et al．Anti-sense RNA inhibits the expression of synaptotagmin II in RBL-2H3 and enhances the exocy-tosis of lysosomes in RBL-2H3［J］．J Huazhong Univ Sci Technol，2005，25（2）：117－20．

Construction and identification of recombinant RBL-2H3 cells transfected with hFcεRIα

WANG Nan-nan1，LIU Zhong-cheng1，ZHANG Yan-fen2，LIU Yu-xin1，CUI Zhe1，CHEN Yao1
（1．College of Pharmaceutical Sciences，2．Science and Technology Office，Hebei University，Baoding Hebei 071002，China）

Abstract：Aim To construct the stable hFcεRIα／RBL-2H3 cell line expressing human FcεRIα（hFcεRIα）．Methods The human FcεRIα gene was obtained by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo．Then，the pCI-neo-hFcεRIα vector was transfected into RBL-2H3 cells by lipo-somes，and the transfected cells were screened through G418 fil-tration subsequently．Finally，RT-PCR，Western blot and immu-nofluorescence assay were used to determine the result of trans-fection．Results According to the optimized transfection param- eters，the transfection efficiency reached 75．38%．The results of Western blot，immunofluorescence and RT-PCR showed that hFcεRIα could be expressed in RBL-2H3 cells successfully．Conclusion HFcεRIα／RBL-2H3 cells were successfully con-structed，which will be the experimental basis for further study on the mechanism of IgE／FcεRI and drugs for allergy diseases．

Key words：hFcεRIα；immunoglobulin E；RBL-2H3 cell；lipo-some transfection；G418 filtration；stable cell line

作者簡介：王南南（1990－），女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail：858500370＠qq．com；張艷芬（1979－），女，碩士，講師，研究方向：生化藥學及分子藥理學，通訊作者，Tel：0312-5079483，E-mail：zhangjing＠hbu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81202338）；河北省自然科學基金資助項目（No H2013201128）；中國博士后科學基金資助項目（No 2013M530885）；河北省教育廳項目（No Z2015013）

收稿日期：2015－04－24，修回日期：2015－05－18

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1174－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．029