光譜法研究頭孢克肟與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里，成飛翔

（曲靖師范學院化學化工學院，云南曲靖 655011）

光譜法研究頭孢克肟與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里，成飛翔

（曲靖師范學院化學化工學院，云南曲靖 655011）

Study on interaction between cefixime and bovine serum albumin by spectrometry

LIU Li，CHENG Fei-xiang
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011，China）

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．035．html

頭孢克肟（cefixime，CE）是常用消炎藥，目前未見用光譜法研究CE與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的報道，以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機制探討上，而本文在優化實驗條件的情況下從更多方面系統地研究了CE 與BSA的結合反應，除了常規的作用機制的研究，還深入探討了3個不同溫度下兩者的結合位點、結合力類型、結合部位、藥物協同作用以及對BSA構象的影響等。這些研究對于闡明CE在機體內的傳輸、代謝過程及藥理作用具有有益的參考意義。

1　材料與方法

1．1儀器與試劑 F-4600熒光光譜儀（日本日立公司），測定參數：狹縫寬度10．0 nm，光電倍增管負高壓為400 V；

Cary50型紫外可見光譜儀（美國瓦里安技術中國有限公司）；pHS-3C精密酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司）；超級恒溫水浴（DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司）。牛血清白蛋白（BSA，上海楷樣生物技術有限公司）；頭孢克肟（97%，百靈威科技有限公司）；其它試劑均為分析純，經檢測在測量波段均無熒光雜質，實驗用水為超純水。

1．2方法 于10 mL的比色管中依次加入1.0×10－5mol ·L－1的BSA 1.0 mL和不同體積的9.854×10－5mol·L－1的頭孢克肟溶液，0.5 mol·L－1NaCl溶液2．0mL（為維持體系的離子強度）和0.1 mol·L－1，pH＝7.4的Tris-HCl緩沖溶液1 mL用水稀釋至刻度并搖勻，放置25 min。分別在291K、301K、311K溫度下，掃描熒光猝滅光譜和同步熒光光譜（Δλ＝15 nm和60 nm），記錄F0和F（F和F0分別指CE存在與不存在時BSA的熒光強度）。其最大激發波長（λex）和最大發射波長（λem）位于280 nm／340nm處。以相應的CE溶液作為參比，記錄CE-BSA體系的吸收光譜。

2　結果與討論

2．1反應條件的優化 分別考察了緩沖溶液種類、用量、pH值、BSA的濃度、試劑加入順序和反應時間對體系熒光強度的影響。結果表明，選用0.01 mol·L－1，pH＝7.40的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL維持體系酸堿度，1.0×10－6mol ·L－1BSA作為反應濃度，BSA→CE→NaCl→Tris-HCl的加入順序，放置25 min后進行測量時效果最佳。

2．2熒光猝滅光譜 在實驗條件下，CE在測量波段沒有熒光，而BSA的熒光較強，并在λex／λem＝280／340nm處，當CE加入到BSA之后，雖然λex／λem幾乎未發生變化，但是其熒光強度明顯隨著CE濃度的增加而逐漸減弱，表明CE能猝滅BSA的熒光，CE與BSA之間存在著相互作用。

2．3猝滅機制的探討 猝滅過程遵循S-V方程：F0／F＝1＋Ksv［C］＝1＋Kqτ0［C］，式中Ksv為猝滅常數；Kq為速率常數（動態猝滅時最大值約為2×1010L·mol－1·s－1）［1－2］；τ0為熒光體平均壽命，一般為10－8s數量級［1－2］；［C］為CE濃度。按照實驗方法在291K、301K、311K時以F0／F對［C］作圖。根據Kq＝Ksv／τ0可求出不同溫度下的Kq值，結果列于Tab 1中。表中Kq值比動態猝滅最大速率常數大兩個數量級，說明CE對BSA的猝滅不屬于動態猝滅。隨著溫度升高，直線斜率即Ksv減小，正好與靜態猝滅機制相吻合。

若CE對BSA為靜態猝滅，應符合L-B方程［1－2］：（F0－F）－1＝F0－1＋（KLBF0［C］）－1，式中KLB為靜態猝滅結合常數。（F0－F）－1－［C］－1作不同溫度下的L-B曲線，計算KLB值列于Tab 1中，表中3個溫度下的KLB值都在103數量級以上，表明CE與BSA由于發生靜態猝滅而結合力較強。隨著溫度的升高，KLB也逐漸下降，這與因靜態猝滅方式而形成的復合物隨溫度升高，而越不穩定的作用機制正好相符合。

紫外吸收光譜也是一種區分猝滅機制的重要方法［1－2］，實驗表明，CE的加入使BSA中苯環上的π-π*躍遷引起的特征吸收峰從278 nm紅移到290 nm，吸收強度也隨CE濃度的加大而明顯增加。CE的加入引起BSA紫外吸收光譜的變化這一現象，說明CE與BSA間發生反應，有新物質生成，更進一步證明兩者之間的相互作用機制屬于靜態猝滅機制。

2．4結合常數和結合位點 如藥物小分子與BSA大分子存在n個等同且獨立的結合位點，它們相互作用的關系符合lg［（F0－F）／F］＝lgKb＋nlg［C］公式［1－2］。分別在291K、301K、311K溫度下，以lg（F0－F）／F對lg［C］作圖，由直線的斜率和截距可求出CE與BSA不同溫度下的結合常數Kb及結合位點數n，見Tab 1。由Tab 1可知，Kb和n都隨溫度增加而降低，這與因復合物穩定性隨溫度增加而下降的靜態猝滅機制是十分吻合的。3個溫度下的n都約等于1，表明CE與BSA結合后可形成一個結合位點。溫度每升高10K，Kb值減小的程度很小，表明兩者結合作用對溫度變化不敏感。總之，溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶著CE在體內進行運轉、貯存和分配。

2．5熱力學參數與結合力類型 根據熱力學公式［3］，計算291K、301K、311K溫度下CE與BSA結合反應的ΔH，熵變ΔS及吉布斯自由能變ΔG，結果見Tab 2。根據Ross等［3］總結出的的規則判斷，由Tab 2可得，ΔG＜0，表明BSA與CE的反應能自發進行；ΔH＜0，表明反應為放熱反應；ΔS＞0，表明其過程是熵增加的自發過程；ΔH＜0，且ΔS＞0，表明靜電作用力是CE與BSA的主要結合作用力。

Tab 2 Thermodynamic parameters and value of nHat different temperatures

2．6結合位置的確定 大多數藥物在BSA上結合部位為亞螺旋域ⅡA（含有酪氨酸和色氨酸）和亞螺旋域ⅢA（含有酪氨酸）［4－5］。在波長280 nm和295 nm激發下，CE對BSA的猝滅程度曲線是分開獨立的，沒有交叉和重疊，說明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，對比這兩種波長下的熒光猝滅程度可知，在280 nm激發時降低程度更大些，這一現象說明在CE與BSA的結合過程中，結合位點主要位于亞螺旋域ⅡA。

2．7藥物協同性 BSA具有多重結合部位，藥物與BSA結合時，BSA各結合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協同作用［4－5］，可用Hill方程［4－5］進行分析，CE-BSA的nH值的計算結果見Tab 2。Tab 2表明，3個溫度下的nH都小于1，表現為負協同作用［4－5］，說明CE與BSA結合過程中，隨著配體CE不斷地結合到位點，使得后繼配體對BSA的親和性減弱，即前一個藥物分子結合到BSA位點上后，對后一個藥物分子與BSA的結合起到阻礙作用。隨著溫度的變化，雖然nH變化不大，但也隨溫度升高而增加，說明溫度的提升對CE藥物小分子之間的協同作用有利。

2．8頭孢克肟對BSA構象的影響 在Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm條件下測CE加入BSA之后的同步熒光光譜，隨CE濃度的增大，酪氨酸和色氨基酸殘基的λmax幾乎沒有發生移動，說明CE的加入不改變了BSA的構象［2］。

3　結論

用熒光和紫外光譜法推斷CE對BSA熒光產生靜態猝滅，CE和BSA之間的作用力類型主要為靜電作用力。測得291K、301K、311K的Kb、n和nH。CE與BSA可形成一個結合位點，表明CE可被BSA運輸。nH＜1，表明CE對結合反應產生負協同作用，即CE加入使BSA的親和性減弱，不利于后續CE與BSA的結合。結合部位在BSA的亞螺旋域ⅡA中。同步熒光光譜表明CE幾乎不對BSA構象產生影響。該研究結果為了解CE在體內的運輸和代謝過程、毒性機制提供了重要信息。

參考文獻：

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中國圖書分類號：R341．21；R977．6；R 978．11

關鍵詞：頭孢克肟；熒光猝滅；相互作用；牛血清白蛋白；結合部位；協同作用

Key words：cefixime；fluorescence quenching；interaction；BSA；binding site；cooperative effect

作者簡介：劉 里（1982－），女，碩士，講師，研究方向：藥物化學和分子發光學理論與應用，E-mail：m18908746298＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 21261019）；云南省教育廳科研項目（No 2012Y414）

收稿日期：2015－05－14，修回日期：2015－06－11

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1183－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．032