人C1q／TNFα相關蛋白-6的表達、純化及生物活性分析

李洪波，高學飛，李 娜，吳東海

（1．懷化學院生命科學系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2．中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

人C1q／TNFα相關蛋白-6的表達、純化及生物活性分析

李洪波1，2，高學飛2，李 娜2，吳東海2

（1．懷化學院生命科學系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2．中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

中國圖書分類號：R-332；R378.21；R341；R394.2；R977．6

摘要：目的 利用大腸桿菌表達可溶性hCTRP6蛋白并分析其活性。方法 重組載體轉化大腸桿菌表達菌株、IPTG誘導表達、純化后測定活性。結果 Trx-hCTRP6蛋白在大腸桿菌中高效表達，經鎳親合純化和分子篩純化，Trx-hCTRP6在細胞和動物水平上都有生物活性。結論 利用大腸桿菌表達系統高效制備了具有生物活性的Trx-hCTRP6蛋白。

關鍵詞：C1q／TNFα相關蛋白-6；大腸桿菌；重組蛋白；親合純化；蛋白印跡；分子篩

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．030．html

C1q／腫瘤壞死因子相關蛋白（C1q and tumor necrosis factor related proteins，CTRPs）是一類在結構和功能上與脂聯素類似的蛋白［1－5］。所有CTRPs蛋白都以三聚體作為分泌的基本結構單元，可以形成6聚體、12聚體、18聚體以及更高形式的多聚體；CTRP3、CTRP5、CTRP6和CTRP10的三聚體通過二硫鍵進一步聚集成更有序的低聚物；除了形成同源低聚物，CTRP1／CTRP6、CTRP2／CTRP7和脂聯素／CTRP2可以作為異源低聚體分泌［1－5］。不同CTRPs間的生物功能各異，例如：CTRP1特異性結合膠原纖維并阻斷膠原介導的血小板聚集，阻止血栓形成，且具有降血糖功能，能增加胰島素敏感性等；CTRP2球狀結構域具有增加肝臟糖原合成、促進脂肪酸的氧化及胰島素增敏作用；CTRP-3能夠抑制趨化因子的釋放，CTRP5在眼部發育過程中起一定的作用，CTRP11與脂肪形成有關，CTRP13激活AMP的磷酸化并參與脂肪酸的代謝調節［2－5］。CTRP6可以誘導巨噬細胞白細胞介素-10（IL-10）的表達。CTRP6球狀區（gCTRP6）劑量依賴性地增加IL-10的表達水平，并且gCTRP6可以迅速誘導ERK1／2的磷酸化。使用選擇性抑制劑U0126后，CTRP6誘導的IL-10表達被阻斷。由于IL-10是一個有效的抗炎細胞因子，可以調節炎癥信號通路，所以CTRP6可能是一個抗炎藥物的新靶點；另外，CTRP6球狀區可以在骨骼肌細胞中調節磷酸化并激活AMPK。在肌細胞中，CTRP6誘導乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的磷酸化和脂肪酸氧化，CTRP6在能量代謝中可能具有重要功能［1，6－7］。本研究將以大腸桿菌為宿主菌，制備重組hCTRP6蛋白，在動物和細胞水平上分析能量代謝調節活性。

1　材料

表達菌株BL21-codonplus（DE3）、表達載體pET32a（＋）購自Invitrogen公司。鎳親和層析樹脂購自Qiagen公司，分子篩Sephadex G-75購自于GE公司，p-AMPKα、AMPKα及β-actin抗體購自CST公司（Cell Signaling Technology，Inc）。8周齡的C57BL／6♂小鼠由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院實驗動物中心飼養。各種工具酶為TaKa-Ra公司產品，PCR引物由Invitrogen合成，一般化學試劑為Sigma分析純。

2　方法

2．1表達載體構建及表達產物的驗證 上游引物PF：5′-GCCCATGGCCTTTGACAGAGCTGTG-3′（CCA TGG NcoI位點）；下游引物PR：5′-CGCTCGAG-GTCGTCCTCGGCCTTGATG-3′（CTCGAG XhoI位點）；以從北京義翹神州生物技術有限公司（Sino Bi-ological Inc．）購買hCTRP6的cDNA為模板，PCR擴增目標片段、構建重組載體pET32／hCTRP6并轉化入大腸桿菌BL21-codonplus（DE3）菌株。隨機挑取5個轉化子單菌落，接種至20 mL含50 mg·L－1Amp LB液體培養基的50 mL三角瓶中，37℃、250 r ·min－1培養至A600＝0.6～0.8，加入終濃度0.1 mmol·L－1IPTG，20℃誘導5 h，取菌液2 mL，離心得菌體，向菌體中加入PBS溶液（1%曲拉通X-100、3 mmol·L－1PMSF）200 μL，超聲破碎，離心取上清，加入上樣緩沖液，熱變性后SDS-PAGE分析。

2．2重組蛋白純化 取過夜培養種子菌2 mL，接種至200 mL LB（含50 mg·L－1Amp）培養基中，37℃、250 r·min－1培養至A600＝0.6～0.8，于20℃誘導8 h，離心取菌體。鎳親合純化參照精編分子生物學實驗指南和文獻進行［8－12］。將鎳親合純化后的蛋白利用曲拉通X-114去除內毒素并超濾濃縮，Superdex G-75分子篩進行純化，具體步驟參照文獻進行［8，12］。取不同咪唑濃度的蛋白洗脫液和經分子篩純化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液、經煮沸變性后，12%SDS-PAGE分析純化情況，純化蛋白利用兔抗His×6抗體蛋白印跡分析。Trx（硫氧還蛋白）的表達與純化參照文獻進行［8］。

2．3重組蛋白活性分析 小鼠肌管前體細胞C2C12分化為肌管細胞參照文獻進行［8］。分化細胞無血清DMEM饑餓12 h，加入終濃度為2 mg· L－1Trx-hCTRP6蛋白溫育不同時間，用含蛋白磷酸化酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解細胞，離心收集蛋白上清、BCA法測定濃度、12%SDS-PAGE分離蛋白、轉膜并利用相應抗體進行Western blot分析。

C57BL／6小鼠于中科院廣州生物醫藥與健康研究院動物中心飼養，實驗操作嚴格按照動物委員會的相關規定開展。實驗小鼠在實驗前先測定其基礎血糖濃度；之后，按2 μg·g－1體重腹腔注射經6 h饑餓的6周齡♂小鼠，腹腔注射9只，尾靜脈取血10 μL，測定注射后0、1、2、3、4、5及6 h的血糖濃度；同時，設注射Trx的對照實驗小鼠8只，腹腔注射與注射hCTRP6組等體積的Trx（2 μg·g－1體重）作為對照。

3　結果

3．1表達產物驗證 挑取pET32／hCTRP6重組載體的大腸桿菌BL21轉化子數個，于IPTG誘導前后分別提取可溶性總蛋白，蛋白質的SDS-PAGE分析結果如Fig 1所示。未經IPTG誘導的轉化子（泳道5）在50 ku左右沒有特異表達產物，而4株經IPTG誘導的BL21轉化子（泳道1－4）在50 ku左右有明顯的蛋白表達（箭頭所示），hCTRP6蛋白理論分子質量約30 ku，其N-端融合了Trx片段（理論分子質量約20 ku），hCTRP6全長蛋白與Trx融合蛋白的表達產物理論分子質量大小約50 ku，該蛋白的分子質量大小與預期分子質量相符，說明實現了重組Trx-hCTRP6蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。

Fig 1 SDS-PAGE identification of soluble expression of Trx-hCTRP6

3．2重組蛋白的純化 SDS-PAGE分析結果表明，含100、200及300 mmol·L－1咪唑的洗脫緩沖液能將目標蛋白從樹脂上洗脫，當咪唑為300 mmol· L－1時，目標蛋白的純度最高（Fig 2A）。純化結果說明，利用鎳親合層析可以對Trx-hCTRP6蛋白有效純化。將300 mmol·L－1咪唑洗脫的蛋白樣品收集，利用曲拉通X-114除去內毒素后將蛋白于PBS中透析后超濾濃縮，Sephadex G-75分子篩對重組蛋白進一步純化，分子篩純化蛋白SDS-PAGE結果如Fig 2B所示，從Fig 2B可看出，經分子篩后收集的樣品5和6純度最高，SDS-PAGE結果中看不到雜蛋白條帶。將收集的樣品5和6合并后超濾濃縮，分別取10和1 μg進行SDS-PAGE及Western blot分析，結果如Fig 2C所示，純化的樣品具有很高的純度，在目標位置的印跡條帶明顯。

3．3活性分析 純化的Trx-hCTRP6經刺激C2C12分化肌管細胞。蛋白印跡分析信號轉導相關蛋白磷酸化變化情況，結果顯示，Trx-hCTRP6能激活AMPKα的磷酸化，Trx蛋白不能激活AMPKα的磷酸化。AMPKα的磷酸化結果如Fig 3A所示，經2 mg·L－1的hCTRP6刺激10 min，AMPKα的磷酸化程度增加；當Trx-hCTRP6刺激超過20 min，AMPKα磷酸化的增加更趨于明顯。以上蛋白印跡結果表明，大腸桿菌表達的Trx-hCTRP6具有生物活性。

Fig 2 Purification of fusion recombinant protein of Trx-hCTRP6

降血糖活性測定結果表明：在注射前和注射重組蛋白1～2 h內，兩組小鼠的血糖水平沒有明顯差異；在注射3～4 h內，注射Trx-hCTRP6的實驗組小鼠的血糖要低于注射Trx的對照小鼠，兩者之間存在明顯差異；但注射4 h后，兩實驗組小鼠的血糖濃度間的差異消失（Fig 3B）。動物實驗結果進一步證明，利用大腸桿菌表達純化的Trx-hCTRP6具有生物活性。

4　討論

目前，已成功克隆到至少15個高度同源的脂聯素類似物，雖然CTRPs在結構上具有相似性，但是它們參與的生理過程存在明顯差異［1－5］。越來越多研究表明，CTRPs除參調節能量代謝外，在心血管疾病中也發揮重要生理功能。例如：CTRP9通過激活AMPK信號通路改善心肌缺血／再灌注損傷肥胖所致的脂肪細胞因子產生失衡是心血管疾病發病的一個重要原因；CTRP6在頸動脈球囊拉傷處高表達，過表達CTRP6進一步促進球囊拉傷處血管內膜增生等。

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-hCTRP6

本研究主要目的在于制備活性CTRP6重組蛋白。我們已經制備了具有生物活性的CTRP1和 2全長及球狀功能區蛋白，與CTRP1和2重組蛋白相比較，Trx-hCTRP6有激活AMP磷酸化的作用，但在檢測動物水平的降血糖活性時，Trx-hCTRP6蛋白在注射3 h后呈現出降血糖活性，降血糖活性僅能維持至注射后4 h。之前表達的CTRP1和2或其球狀功能區，降血糖活性在注射1 h后與對照組有明顯差異，在注射2 h后差異更為明顯，并且其降血糖活性至少維持5 h以上［8－11］。因此，相比較CTRP1 和2，Trx-CTRP6的降血糖活性明顯低于它們，這也意味著不同CTRP之間的降血糖效應存在差異。總之，本研究為hCTRP6蛋白的可溶和活性表達找到了一種有效方法，為該蛋白的應用及機制研究奠定了基礎。

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Expression，purification and biological activities assay of human C1q and tumor necrosis factor related protein-6

LI Hong-bo1，2，GAO Xue-fei2，LI Na2，WU Dong-hai2
（1．Dept of Life Sciences，Huaihua College，Huaihua Hunan 418008，China；2．Guangzhou Institute of Biomedicine and Health，CAS，Guangzhou 510530，China）

Abstract：Aim To prepare soluble human C1q and tumor necrosis factor related protein-6 in Escherichia coli and analyze the bioactivity．Methods Recombi-nant plasmid was transformed into E．coli expression strain，and the recombinant protein Trx-hCTRP6 was expressed induced by IPTG and then purified．Results

Trx-hCTRP6 was expressed efficiently and purified using Ni-NTA affinity chromatography and Superdex G- 75 column．The purified Trx-hCTRP6 was shown to be active under in vivo and in vitro assay conditions．Con-clusion Active Trx-hCTRP6 is efficiently prepared from E．coli protein expression system．

Key words：C1q and tumor necrosis factor related pro-tein-6；Escherichia coli；recombinant protein；affinity purification；Western blot；gel filtration chromatogra-phy

作者簡介：李洪波（1980－），男，博士，副教授，研究方向：生物制藥及生物化學與分子生物學，通訊作者，E-mail：lihong-bo8007＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81300655）；湖南省重點學科建設項目（No 2011042）；廣東省科技計劃項目（No 2013B051000090）

收稿日期：2015－03－12，修回日期：2015－04－14

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1165－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．027