大鼠炎癥牙髓中鈉離子通道Nav1.7的表達

李 炯 蔣 勇

·基礎研究·

大鼠炎癥牙髓中鈉離子通道Nav1.7的表達

李 炯 蔣 勇

目的 探討大鼠炎癥牙髓中鈉離子通道Nav1.7的表達。方法60只SD大鼠分為正常組(A組)和炎癥組，炎癥組中，封脂多糖(LPS)1 d為B組、3 d為C組、5 d為D組。炎癥組通過置入LPS誘導產生牙髓炎。通過HE染色觀察各組大鼠牙髓組織病理學改變，通過免疫組化和ELISA檢測各組大鼠牙髓中Nav1.7的表達。結果各組牙髓組織病理學發生改變，各組牙髓切片中均有Nav1.7的表達。ELISA結果顯示，4組牙髓中Nav1.7的表達量分別為(3.38±0.10)、(3.67±0.15)、(4.04±0.14)和(4.25±0.11)μg/L，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論Nav1.7的表達增高可能與牙髓炎癥具有潛在關聯性。

大鼠；炎癥；牙髓炎；Nav1.7

Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9與疼痛的關系密切[1]，尤以Nav1.7亞型與人類疼痛的聯系最為緊密。 目前，鈉離子通道亞型和口腔頜面部疼痛關系的報道日益增多，因而研究口頜面部疼痛和鈉離子通道亞型表達的關系成為熱點。本研究通過免疫組化和ELISA對Nav1.7在大鼠正常牙髓和炎癥牙髓組織中的表達進行了定性、定量分析，探究Nav1.7的表達與牙髓炎癥的關聯性，為治療牙髓炎伴發疼痛提出新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，體質量300～350 g，雄性，清潔級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。所有大鼠牙列完整，咬合關系正常，無齲壞，無牙周病，無牙齒畸形。

1.1.2 實驗藥品、試劑 兔抗Nav1.7多克隆抗體購自美國Anbobio公司；即用型免疫組化ElivisionTMplus 廣譜試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司；大腸桿菌內毒素購自美國Sigma公司；ELISA檢測試驗盒購自上海源葉生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 參照相關研究[2，3]，60只SD大鼠，隨機分為正常組(A組)和炎癥組。炎癥組中，封LPS 1 d為B組、3 d為C組、5 d為D組。每組各15只實驗大鼠，飼養于動物房，喂食硬質鼠料，飼養環境安靜，室溫在20℃左右，適應性飼養1周后進行實驗。大腸桿菌內毒素,用生理鹽水稀釋為濃度為5 μg/μL的溶液，備用。實驗組大鼠稱重，10%水合氯醛腹腔麻醉，取其仰臥位，上頜及四肢固定于鼠板上。75%酒精消毒大鼠上下頜前牙區，10#金鋼砂球鉆切斷牙冠，暴露穿髓點，將浸潤有內毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的紙尖置于穿髓點，玻璃離子暫封，正常環境下軟食飼養。各組大鼠在相應時間處死，分離上下頜切牙。每組中5只大鼠牙髓標本用于牙髓切片常規HE染色，5只大鼠牙髓標本用于免疫組織化學分析Nav1.7的表達，5只用于ELISA法檢測Nav1.7的表達。

1.2.2 一般情況觀察 為確保大鼠牙髓炎模型造模成功，仔細觀察大鼠的動物行為。每隔3 h對大鼠行為進行觀察，觀察大鼠在進食量、添足、嘶叫等行為上是否發生改變，并用熱牙膠刺激大鼠的患牙，觀察是否出現甩頭等現象。

1.2.3 牙髓切片制備 麻醉后的大鼠用預冷的4%多聚甲醛行心臟灌流，灌流結束后，立即取上下頜前牙，4%多聚甲醛固定48 h，自來水流水沖洗數小時，PBS 漂洗20 min。然后組織入10%EDTA脫鈣液，3～4 d更換1次脫鈣液，40 d左右至骨組織變柔軟為止。酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。載玻片先進行防脫處理；Leica切片機切片、裱片、烤片、待用。

1.2.4 牙髓切片HE染色 石蠟切片常規脫蠟至水；蘇木精染色10 min，將細胞核染成藍色，自來水洗去浮色；分色數秒；藍化；復制伊紅染色10 s左右，將細胞質染成紅色；分色；干燥；封片；觀察。

1.2.5 免疫組織化學 石蠟切片常規脫蠟至水；PBS洗3次，每次3 min；滴加3% H2O2，37℃靜置15 min；PBS洗3次，每次3 min；微波修復，高火5 min，冷卻5 min，重復1次；PBS洗3次，每次3 min；滴加Ⅰ抗(1 ∶100稀釋)50 μL/片，4℃過夜；4℃過夜后需在室溫復溫20 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP標記Ⅱ抗工作液50 μL/片，37℃ 20 min；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色1～5 min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗；蘇木精復染2 min；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、烤片、顯微鏡拍照。

1.2.6 ELISA法 4組大鼠在預定的時間點脫頸處死，取出牙髓標本置于-80℃冰箱速凍保存。參照ELISA檢測試驗盒說明書操作步驟,采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗檢測各組大鼠牙髓組織中Nav1.7的表達。

2 結果

2.1 牙髓切片HE染色 A組牙髓切片可見排列緊密的成牙本質細胞靠近牙本質內層，牙髓內有大量牙髓細胞，細胞呈星形，核染色深，胞漿淡染、均勻，在牙髓間質內有血管、神經，見圖1A。B組牙髓切片可見牙髓組織大致正常，血管輕度擴張，有部分中性炎細胞浸潤，牙髓中纖維組織排列輕度紊亂，有少量紅細胞，見圖1B。C組牙髓切片可見血管中度擴張，有多數中性炎細胞浸潤，牙髓中纖維組織排列中度紊亂，血管擴張變形明顯，血管腔內可見紅細胞，見圖1C。D組牙髓切片可見牙髓中纖維組織排列重度紊亂，部分纖維組織消融，血管重度擴張，血管腔內有大量紅細胞，見圖1D。

2.2 免疫組織化學 Nav1.7免疫組化結果顯示各組大鼠牙髓切片可見棕黃色或褐色陽性表達。A組牙髓切片中Nav1.7陽性表達幾乎沒有，見圖2A。B、C、D組中Nav1.7的陽性表達隨著時間和炎癥的增加呈升高，見圖2B、2C、2D。

2.3 ELISA法 大鼠牙髓組織中均有Nav1.7的表達，Nav1.7平均光密度與含量隨著炎癥時間的增加而升高。4組間大鼠Nav1.7含量差異有統計學意義(F=48.231,P=0.000)，兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠牙髓切片中Nav1.7表達

3 討論

當牙髓發生急性炎癥時，隨著血管擴張、充血，炎癥細胞浸潤，血管通透性增加，髓腔內的壓力會明顯增高，從而壓迫神經纖維而引發疼痛[4]。牙痛是神經痛中常見的一種，神經性疼痛產生的主要原因是神經元的異常興奮，在這種痛敏過程中，電壓門控鈉離子通道起了關鍵性的作用。本研究通過LPS制備大鼠牙髓炎模型，通過HE染色、免疫組織化學和ELISA法定性、定量研究各組大鼠Nav1.7的表達。

Byers等[5]發現Nav1.1～Nav1.9在大鼠各個生命階段的不同部位的成牙本質細胞細胞膜上均有表達，且電壓門控鈉通道可能參與了感受刺激的過程，本研究與上述研究結果相符。本實驗正常組和炎癥組中Nav1.7均有表達，且Nav1.7表達隨炎癥天數的增加而升高，免疫組化和ELISA法實驗結果顯示各組之間均有顯著差異性。

本實驗研究的Nav1.7主要表達在外周感覺神經元上，介導快激活快失活的TTX-S電流。Nav1.7能在較弱的刺激下允許鈉離子持續內流，提高神經元的去極化水平，可將最初的疼痛電信號放大并促使神經元持續興奮，在外周神經性疼痛和炎性疼痛通路中發揮重要作用[6]。另外，Ichikawa等[7]通過膜片鉗在培養的人成牙本質細胞檢測到電壓依賴性鈉通道，提示鈉通道在通道受體信號相互作用和膜電位調控所驅動的細胞功能中起到了重要作用。上述研究均顯示鈉離子通道可能作為中介傳遞了成牙本質細胞和牙本質小管流體流動之間的信號，參與了牙痛的感覺發生過程。

本研究Nav1.7的表達量和炎癥程度呈正相關，即炎癥組Nav1.7的表達隨著炎癥程度增強而升高，這可能與炎癥介質的作用有關。前列腺素、緩激肽、自由基、陽離子和神經生長因子的釋放，增加了VGSCS的表達，并且表現為原發性痛覺致敏[8]。前列腺素E2、5-羥色胺、腺苷、腎上腺素、內皮素和神經生長因子可以通過包括PKA、PKC在內的第二信使通路，導致鈉離子傳導速度快速上升、電壓依賴性激活曲線向超極化移動和加速TTX-R鈉電流產生，從而增強神經元的興奮性，導致傷害感受器敏化和痛覺致敏[9]。

本研究正常組和炎癥組Nav1.7均有表達。因此，如果本研究能通過電生理和膜片鉗技術，記錄分離的牙髓細胞與神經元中施加牙髓炎相關炎癥介質和鈉通道阻滯劑，前后Nav1.7的電流密度、通道開閉時程、電流振幅及動作電位的變化，將更進一步揭示牙髓炎痛覺致敏模型中Nav1.7與疼痛的關系。

通過本研究，發現牙髓炎的疼痛可能與Nav1.7的表達升高有潛在關聯，但口頜面部疼痛的發生是一個復雜過程，Nav1.7僅僅可能做為一個參與因素，具體牙髓炎致敏的痛覺傳導機制有待進一步研究。

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[2] 顧斌,劉洪臣,郭宏,等.大鼠急性牙髓炎動物模型的建立[J].中華老年口腔醫學雜志，2009,7(5):304-307.

[3] Esmaeili A,Akhavan A,Bouzari M,et al.Temporal expression pattern of sodium channel Nav1.8 messenger RNA in pulpitis[J].Int Endod J,2011,44(6):499-504.

[4] 盧偉,張紅,韓東.3種方法對于控制急性牙髓炎疼痛的比較研究[J].安徽醫學,2012,33(2)：167-169.

[5] Byers MR,Westenbroek RE.Odontoblasts in developing,mature and ageing rat teeth have multiple phenotypes that variably express all nine voltage-gated sodium channels[J].Arch Oral Biol,2011,56(11):1199-220.

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[8] Esmaeili A,Akhavan A,Bouzari M,et al.Temporal expression pattern of sodium channel Nav1.8 messenger RNA in pulpitis[J].Int Endod J,2011,44(6):499-504.

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(2014-11-18 收稿 2015-03-20 修回)

Expression of voltage gated sodium channel Nav1.7 in rat pulpitis

LiJiong,JiangYong

StomatologicHospital&College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLabofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China

Objective To investigate the expression of voltage gated sodium channel Nav1.7 in rat pulpitis. Sixty rats were randomly divided into a nontreatment group(A)and three inflammation groups: day1(B), day3(C) and day5(D), and pulpitis was induced by creating pulp exposures to LPS in rat incisions. Histopathological changes and the expression of Nav1.7 were observed by Hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry and ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) in each team.ResultsHistopathological changes were revealed in each team, while Nav1.7 was also expressed. ELISA results revealed that the level of Nav1.7 in control pulp tissue was (3.38±0.10) μg/L, in painful pulp tissue of 1d group was(3.67±0.15)μg/L, in painful pulp tissue of 3d group was(4.04±0.14)μg/L and in painful pulp tissue of 5d group was(4.25±0.11)μg/L(P<0.05).ConclusionThe relationship between dental pain and Nav1.7 expression level maybe exist.

Rats;Inflammation;Pulpitis;Nav1.7

安徽醫科大學校基金課題(項目編號：2012xkj022)

230032 合肥 安徽醫科大學附屬口腔醫院，安徽醫科大學口腔醫學院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.06.001