江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性分析

王蘭萍， 耿榮慶， 朱華杰， 鄭 慧， 王夢迪， 張子鎖

(1．鹽城師范學院生命科學與技術學院，江蘇鹽城 224051；2．鹽城師范學院藥學院，江蘇鹽城 224051)

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江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性分析

王蘭萍1， 耿榮慶2*， 朱華杰2， 鄭 慧2， 王夢迪2， 張子鎖2

(1．鹽城師范學院生命科學與技術學院，江蘇鹽城 224051；2．鹽城師范學院藥學院，江蘇鹽城 224051)

[目的] 為中華大蟾蜍野生種群資源的保護和合理開發(fā)利用提供理論依據。[方法] 通過對中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進行測序分析，研究江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性。[結果] 在江蘇省沿海灘涂的3個地域檢測到中華大蟾蜍種群的6個單倍型類型，東臺種群、大豐種群和射陽種群的個體間享有共享的單倍型類型，其余單倍型均是各種群獨享。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，中華大蟾蜍3個地域種群沒有形成明顯的地理分布格局。[結論] 各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

中華大蟾蜍；線粒體控制區(qū)；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育樹

蟾蜍隸屬兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蟾蜍科(Bufonidae)、蟾蜍屬(Bufo)，在我國各地均有分布，并且在不同海拔的各種生境中數量都較多。江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍(Bufogargarizans)和花背蟾蜍(Buforaddei)都是江蘇沿海地區(qū)常見的蟾蜍種類[1]，喜棲息于水邊、草叢等陰暗潮濕的地方。它們不僅是農作物害蟲的天敵，而且是一種動物源藥材蟾酥的來源。筆者通過對中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進行測序分析，探討江蘇省沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性，以期為中華大蟾蜍野生種群資源的保護和合理開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源中華大蟾蜍樣本采集自江蘇省鹽城市沿海灘涂地區(qū)，采用隨機抽樣的方法分別從東臺市、大豐市和射陽縣3個地域取樣，每個地域樣本數量均為10只。所有樣本帶回實驗室于-80 ℃下冷凍保存。

1．2 基因組DNA提取、mtDNA控制區(qū)PCR擴增及測序剪取約0.5 g的中華大蟾蜍肌肉樣本，采用組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，TE溶解后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴增mtDNA控制區(qū)序列的PCR引物參照文獻[2]，上、下游引物序列分別為P1：5′-GCACGATAGCAAGGAACAC-3′和P2：5′-CCGCTTTAAGGTACGATA-3′。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR擴增體系(50 μl):5 μl 10×Buffer、4 μl 25 mmol/L MgCl2、4 μl 2.5 mmol/L dNTPs，10 pmol/μl 上游、下游引物各為1 μl，0.3 μl 5 U/μlTaqDNA 聚合酶、1 μl 100 ng/μl DNA模板，余下體積用滅菌超純水補足。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。

將PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠回收試劑盒回收純化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向測序。

1．3 DNA序列數據分析所有測序獲得的DNA序列使用DNAstar軟件進行編輯、校對和排序，依據測序峰圖手工校正。各個群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性采用DnaSP4.0[3]軟件計算；使用Clustal X1.83[4]軟件進行序列的比對，系統(tǒng)發(fā)育分析使用MEGA5.0軟件[5]，分別采用鄰接法(NJ)和最小進化法(ME)構建系統(tǒng)進化樹，自展法1000次重復抽樣估計系統(tǒng)樹中結點的置信水平。

2 結果與分析

2．1 mtDNA控制區(qū)序列特征測序獲得的PCR擴增片段經與GenBank數據庫中中華大蟾蜍線粒體基因組(NC_008410)比對分析表明，擴增的mtDNA控制區(qū)序列長度均為366 bp，未發(fā)現插入和缺失序列。測定的序列中共發(fā)現8個變異位點(圖1)，包括6個簡約信息位點和1個單一變異位點；A、T、C、G堿基的平均含量分別為36.6%、31.3%、21.0%和11.1%。

單倍型分析表明，在東臺種群中檢測到4種類型(DT1、DT2、DT3)，大豐種群中檢測到3種類型(DF1、DF2、DF3、DF4)，射陽種群中檢測到3種類型(SY1、SY2、SY3)；東臺、大豐和射陽種群的單倍型多樣性分別為0.711、0.822和0.600，核苷酸多樣性則分別為 0.007 23、0.007 77和0.006 80(圖1)。

圖1 單倍型類型及序列比對

2．2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析采用鄰接法和最大簡約法構建的中華大蟾蜍mtDNA控制區(qū)單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關系如圖2所示。從圖2可以看出，2種方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構完全相同，只是在單倍型的分支順序上存在差異。基于單倍型序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，中華大蟾蜍的6種單倍型可分為2個分支，每個分支中均包含了東臺、大豐和射陽種群中的單倍型類型；東臺種群、大豐種群和射陽種群共享了1種單倍型，東臺種群和大豐種群、東臺種群和射陽種群還分別共享了其他的單倍型。這表明中華大蟾蜍3個地域種群沒有形成明顯的地理分布格局。

3 討論

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎，而且是物種進化潛能的保證。遺傳多樣性水平的下降可能導致物種對環(huán)境適應能力的降低，這對生活在野外多變環(huán)境中的群體而言是一個極大的威脅[6-7]。因此，在基因水平上檢測種群的遺傳多樣性有助于了解物種的種群遺傳結構和種群歷史，進而了解其演化過程，最終有助于制定科學的保護策略。

該研究中從中華大蟾蜍種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析表明，2個參數都是大豐種群最高，而射陽種群最低，表明大豐種群的遺傳多樣性最高而射陽種群的遺傳多樣性最低，而出現這種狀況可能與種群所處的環(huán)境相關。通常認為，當1個種群在相當長的時間內比較穩(wěn)定且資源量豐富時，該種群可能會維持較高的遺傳多樣性。近年來，由于規(guī)模化的沿海灘涂開發(fā)、圍海造田以及化學污染，在一定程度上大幅度地減少并割裂了江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍的棲息地，過度的人工捕捉也造成了其野生種群數量的下降。特別是射陽灘涂受到的人為干擾程度最大，從而可能導致該地域內中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性水平下降。

注：A.鄰接法(NJ)；B.最大簡約法(ME)。圖2 基于mtDNA控制區(qū)單倍型構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹

在江蘇省沿海灘涂的3個地域檢測到中華大蟾蜍種群的6個單倍型類型，東臺種群、大豐種群和射陽種群的個體間享有共享的單倍型類型，其余單倍型均是各種群獨享，獨享單倍型的存在表明這些地域種群之間已呈現出一定程度的遺傳分化。采用不同方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹更進一步表明，3個不同種群的中華大蟾蜍分屬于2個不同的譜系，但這2個分支與地理分布不相關，表明中華大蟾蜍正處于譜系重排(Lineage sorting)階段而并沒有按采樣點的地理單元分開。這說明各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

[1] 蔣志剛，丁玉華.大豐麋鹿與生物多樣性[J].北京：中國林業(yè)出版社，2011.

[2] HU Y L，WU X B，JIANG Z G，et al.Population Genetics and Phylogeography of Bufo gargarizans in China[J].Biochem Genet, 2007, 45: 697-711.

[4] THOMPSON J D,GIBSON T J,PLEWNIAK F,et al.The CLUSTAL-X windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res, 1997, 25(24): 4876-4882.

[5] TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods[J].Molecular Biology and Evolution, 2011, 28:2731-2739.

[6] VRIJEHOEK R C.Genetic diversity and fitness in small populations.In: Conservation Genetics [M].Basel: Birkhüuser, 1994.

[7] FRANKHAM R,BALLOU J D,BRISCOE D A.Introduction to Conservation Genetics [M].Cambridge: Cambridge University Press, 2002.

Genetic Diversity Analysis ofBufogargarizansPopulation in the Coastal Wetland of Jiangsu Province

WANG Lan-ping1，GENG Rong-qing2*，ZHU Hua-jie2et al

(1.College of Life Science and Technology, Yancheng Teachers University，Yancheng，Jiangsu 224002；2.College of Pharmacy，Yancheng Teachers University, Yancheng, Jiangsu 224002)

[Objective] The research aimed to provide theoretical basis for the protection and reasonable development and utilization of wild resources ofBufogargarizanspopulation.[Method] Based on the sequencing analysis of partial sequence of the mitochondrial control region ofB.gargarizans, the genetic diversity of different geographical population ofB.gargarizansin the coastal wetland of Jiangsu Province was studied.[Result] Six haplotypes were detected from three geographical populations in the coastal wetland of Jiangsu Province.The individuals in Dongtai population, Dafeng population and Sheyang population shared the same haplotypes.But the other haplotypes were exclusive.The results of phylogenesis analysis showed that no obvious geographic distribution pattern was found among three geographical populations ofB.gargarizans.[Conclusion] A certain degree of gene flow and genetic differentiation existed among different geographical populations.

Bufogargarizans；Mitochondrial control region；Genetic diversity；Phylogenetic tree

江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(20131032 4050X)。

王蘭萍(1976- )，女，江蘇海門人，副教授，碩士，從事動物學方面的教學與科研工作。*通訊作者，副教授，博士，從事動物學方面的教學與科研工作。

2015-02-09

S 917

A

0517-6611(2015)08-093-02