腦膠質瘤組織中T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表達及其臨床意義

王永勝，王宗寶，孫靈梅，夏家林

·短篇論著·

腦膠質瘤組織中T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表達及其臨床意義

王永勝，王宗寶，孫靈梅，夏家林

目的檢測腦膠質瘤組織中T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(Tiam1)和Rac GTP酶激活蛋白酶1 (Rac1)蛋白的表達，并探討二者與腦膠質瘤病理分級和生存的關系。方法收集濱州市中心醫院神經外科2007年6月—2012年7月手術切除并經病理證實的腦膠質瘤標本58例，按照世界衛生組織(WHO)中樞神經系統腫瘤2007年分類標準分組:低級別組21例，中級別組17例，高級別組20例;另選擇同期14例正常腦組織標本作為正常對照組。應用免疫組化SP法檢測各組標本中Tiam1和Rac1蛋白的表達情況。并對腦膠質瘤患者進行隨訪，進行Kaplan－Meier生存曲線分析。結果Tiam1和Rac1蛋白的陽性表達率比較，高級別組＞中級別組＞低級別組＞正常對照組(P＜0．05)。腦膠質瘤組織中Tiam1和Rac1蛋白的表達呈正相關(r=0．328，P＜0．05)。Kaplan－Meier生存曲線分析顯示:Tiam1蛋白表達陽性患者的半數生存期為19個月，Tiam1蛋白表達陰性患者的半數生存期為45個月;Rac1蛋白表達陽性患者的半數生存期為17個月，Tiam1表達陰性患者的半數生存期為42個月。腦膠質瘤組織中Tiam1和Rac1蛋白表達陰性者較表達陽性者具有生存優勢(P＜0．05)。結論Tiam1和Rac1蛋白在腦膠質瘤組織中呈高表達，且與腦膠質瘤病理分級和生存期密切相關，聯合檢測Tiam1和Rac1蛋白表達可作為腦膠質瘤增殖能力、惡性程度及生存期的預測指標。

膠質瘤;T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1;Rac GTP酶激活蛋白酶1;病理分級;生存期

王永勝，王宗寶，孫靈梅，等．腦膠質瘤組織中T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表達及其臨床意義［J］．實用心腦肺血管病雜志，2015，23(1):82－84．［www．syxnf．net］

Wang YS，Wang ZB，Sun LM，et al．Protein expressions of Tiam1 and Rac1 in brain glioma and its clinical significance［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):82－84．

腦膠質瘤是發病率較高的顱內原發性腫瘤，約占顱內腫瘤的40%。近年來，雖然腦膠質瘤在基礎及臨床研究方面取得較大進展，但其仍是致死率、致殘率較高的惡性腫瘤之一。目前，關于腦膠質瘤發生、增殖和浸潤轉移的作用機制仍不十分清楚，可能與瘤細胞的抗凋亡作用有關。T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1，Tiam1)是一種從小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離出來的原癌基因，其參與癌基因表達，影響細胞去極化過程，調節細胞骨架重組，參與細胞增殖與凋亡等過程［1］。Rac GTP酶激活蛋白酶1(Rac GTPase activating protein 1，Rac1)是Rho GTP酶超家族成員之一，通過蛋白激酶調節某些轉錄因子的活性來調控腫瘤細胞的分裂周期和轉錄，對腫瘤的增殖、惡性轉型、浸潤轉移及抗凋亡發揮著重要作用。目前，國內有關Tiam1和Rac1蛋白的表達與腦膠質瘤病理分級及生存的關系研究少見。本研究應用免疫組化SP法檢測腦膠質瘤組織和正常組織標本中Tiam1和Rac1蛋白表達情況，探討二者與腦膠質瘤病理分級和生存的關系，以期尋找一個預測腦膠質瘤惡性程度和生存期的指標。

1 資料與方法

1．1 一般資料收集濱州市中心醫院神經外科2007年6月—2012年7月手術切除并經病理證實的腦膠質瘤標本58例，其中男37例，女21例;年齡24～67歲，平均46．3歲。均為首發病例，術前未行放化療。按照世界衛生組織(WHO)中樞神經系統腫瘤2007年分類標準分組:低級別組(因Ⅰ級腦膠質瘤例數較少，與Ⅱ級合在一起作為低級別組)21例，中級別組(Ⅲ級)17例，高級別組(Ⅳ級，均為膠質母細胞瘤) 20例。另選擇同期14例正常腦組織標本作為正常對照組，均為顱腦損傷或腦出血后行顱內減壓術患者。對58例腦膠質瘤患者進行上門或電話隨訪，隨訪6～68個月，平均(34．2 ±23．6)個月。

1．2 試劑與實驗方法

1．2．1 試劑采用常規免疫組化SP法，免疫組化試劑盒(SP 9000 kit)和顯色試劑盒(DAB kit)購自北京中杉生物技術有限公司，兔抗人Tiam1多克隆抗體和鼠抗人Rac1單克隆抗體為美國Santa Cru公司產品。

1．2．2 實驗方法常規石蠟切片脫蠟并水化;3%過氧化氫溶液阻斷、滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗3×5 min;微波加熱修復抗原，PBS沖洗3×5 min;正常羊血清工作液封閉37℃10 min后滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3 ×5 min;Tiam1和Rac1抗體稀釋濃度分別為1 μg/ml和4 μg/ ml，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，37℃孵育30 min，PBS沖洗3 ×5 min;DAB顯色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水，透明，干燥，封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1．3 結果判定標準Tiam1和Rac1蛋白在組織細胞的胞質內出現棕黃色染色為陽性，部分可出現在胞膜上。通過細胞染色強度和陽性細胞計數進行半定量分析。每張切片觀察5個視野，判斷標準［2］:背景清晰無色為陰性(－)，淺黃色細胞數≤10%為可疑陽性(±)，淺黃色細胞數＞10%為弱陽性(+)，棕黃色細胞數≥70%為強陽性(++);其中(－) (±)為陰性，(+)(++)為陽性。

1．4 統計學方法應用SPSS 14．0統計學軟件進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗及四格表確切概率法;相關分析采用Spearman等級相關分析;患者生存時間分析采用Kaplan－Meier法。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組Tiam1和Rac1蛋白的表達情況正常對照組Tiam1蛋白的陽性表達率為14．3%(2/14)，Rac1蛋白的陽性表達率為7．1%(1/14);低級別組Tiam1蛋白的陽性表達率為47．6%(10/21)，Rac1蛋白的陽性表達率為42．9%(9/21);中級別組Tiam1蛋白的陽性表達率為70．6%(12/17)，Rac1蛋白的陽性表達率為76．5%(13/17);高級別組Tiam1蛋白的陽性表達率為90．0%(18/20)，Rac1蛋白的陽性表達率為85．0%(17/20)。Tiam1和Rac1蛋白的陽性表達率比較，高級別組＞中級別組＞低級別組＞正常對照組，差異有統計學意義(P＜0．05)。

2．2 腦膠質瘤組織中Tiam1和Rac1蛋白表達的相關性Tiam1蛋白陽性組織中Rac1蛋白的陽性表達率為85．0%，Tiam1蛋白陰性組織中Rac1蛋白的陽性表達率為27．8%，Tiam1蛋白陽性組織中Rac1蛋白的陽性表達率高于Tiam1蛋白陰性組織，差異有統計學意義(P＜0．05，見表1)。Spearman等級相關分析結果顯示，腦膠質瘤組織中Tiam1和Rac1蛋白的表達呈正相關(r=0．328，P＜0．05)。

表1 腦膠質瘤組織中Tiam1與Rac1蛋白表達的相關性分析(例)Table 1 Analysis of the correlation between the expression of Rac1 protein and Tiam1 in gliomas

2．3 腦膠質瘤組織中Tiam1和Rac1蛋白的表達及生存分析58例腦膠質瘤組織中，Tiam1蛋白表達陽性40例，陰性18例，Kaplan－Meier生存曲線分析顯示:Tiam1蛋白表達陽性患者的半數生存期為19個月，Tiam1蛋白表達陰性患者的半數生存期為45個月，腦膠質瘤組織中Tiam1蛋白表達陰性者較表達陽性者具有生存優勢(P＜0．05，見圖1)。58例腦膠質瘤組織中，Rac1蛋白表達陽性39例，陰性19例，Kaplan－Meier生存曲線分析顯示:Rac1蛋白表達陽性患者的半數生存期為17個月，Tiam1表達陰性患者的半數生存期為42個月，腦膠質瘤組織中Rac1蛋白表達陰性者較表達陽性者具有生存優勢(P＜0．05，見圖2)。

圖1 不同Tiam1蛋白表達患者的生存曲線Figure 1 Survival curves of patients with different Tiam1 expression

圖2 不同Rac1蛋白表達患者的生存曲線Figure 2 Survival curves of patients with different Rac1 expression

3 討論

腦膠質瘤是中樞神經系統常見腫瘤，呈浸潤性生長，具有高增殖性和高侵襲性，其侵襲轉移是患者術后復發和死亡的主要原因。目前，腦膠質瘤的發生、發展、增殖及浸潤轉移機制仍不明確，隨著腦膠質瘤基礎與臨床研究的進展，人們逐漸認識到原癌基因的激活或抑癌基因的失活是腫瘤發生的重要環節，其發生、發展與多基因的異常表達密切相關。近年來研究發現，Tiam1、Rac1蛋白等是重要的腫瘤相關蛋白，其作為復雜信號轉導通路中的一部分在眾多惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要作用。

Tiam1是荷蘭學者Habets等［1］首先從鼠T淋巴瘤分離克隆出來的基因，是一個重要的腫瘤轉移促進基因，屬于Db1家族，具有多個磷酸化位點。研究表明，Tiam1在正常人的平滑肌細胞中表達水平中等，在心肌細胞、支氣管上皮細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞及神經元中表達水平較低，而在其他正常組織細胞中基本不表達［3］。臨床研究顯示，Tiam1蛋白在乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織中陽性表達水平較高并與腫瘤的分化程度、侵襲轉移等關系密切［4－5］。

Rac1是Rac亞家族成員之一，而Rac亞家族又是Rho GTP酶超家族的亞家族成員。Rho GTP酶是細胞內多條信號轉導通路的關鍵分子，作為開關在胞內信號轉導中發揮著重要作用，其在多種惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關，通過改變肌動蛋白細胞骨架的重組而參與細胞遷移。Rac1激活后可誘導質膜突起形成片狀層狀偽足，有助于細胞對周圍環境的適應及確定細胞遷移的方向，還可促使細胞表面整合素家族向細胞頭部聚集，將信號向胞內傳遞，參與細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力，從而促進腫瘤侵襲轉移［6］。Rac1還可以通過激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶增加胞內超氧化物陰離子濃度，從而抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖［7］。

Tiam1基因表達產物能促進整合素介導的異型細胞之間、細胞與基質之間的相互作用，而高表達的Tiam1能持續活化Rho樣蛋白，促進彈力纖維的形成及病灶黏附復合物的形成，參與信號轉導，調節細胞骨架結構，影響細胞去極化過程，促進細胞運動和遷移，誘導腫瘤細胞浸潤轉移［8］。

馬燕俠等［9］采用PCR及Western blot檢測發現，Rac1的表達隨著腦膠質瘤級別的升高而升高，高級別組Rac1 mRNA表達量最高，表明Rac1基因表達與腦膠質瘤惡性程度密切相關。但到目前為止，國內有關Tiam1和Rac1蛋白在腦膠質瘤組織中的表達及其與病理分級和預后的關系的研究較少。本研究采用常規免疫組化SP法檢測腦膠質瘤組織中和正常腦組織中Tiam1和Rac1蛋白的表達情況，結果顯示Tiam1和Rac1蛋白的陽性表達率比較，高級別組＞中級別組＞低級別組＞正常對照組，提示Tiam1和Rac1蛋白的表達可作為反映腦膠質瘤增殖能力和惡性程度的參考指標。另外，本研究結果還發現Tiam1和Rac1蛋白在腦膠質瘤中的表達呈正相關，說明可能存在Tiam1－Rac1信號轉導通路，兩者協同參與了腫瘤浸潤、轉移等病理生理過程，在腦膠質瘤的侵襲轉移中發揮著重要作用。

影響腦膠質瘤患者預后及生存期的因素較多，一些分子生物學指標可能影響腦膠質瘤的發生、發展及病理特征變化，而病理分級又與患者的生存與預后息息相關，因此分析相關分子生物學指標和臨床病理特征與患者預后之間的關系具有較大的臨床價值。本研究通過Kaplan－Meier生存曲線分析顯示，Tiam1和Rac1蛋白表達與患者生存期密切相關，二者陽性表達的患者半數生存期明顯低于二者均陰性表達的患者，說明二者的陽性表達可增加患者生存危險，有助于判斷腦膠質瘤患者的預后。

總之，Tiam1和Rac1蛋白在腦膠質瘤中呈高表達，說明二者在腦膠質瘤的發生、發展、侵襲轉移中發揮著重要的作用，該腫瘤標志物的檢測有助于腦膠質瘤生物學行為的預測與預后的評價，且由于Rac1與腫瘤侵襲轉移密切相關，Rac1可能成為抑制腫瘤轉移的重要靶位，為膠質瘤的早期診斷和治療提供一個新的途徑。

［1］Habets GGM，Scholtes EH，Zuydgeest D，et al．Identification of an invasion－inducing gene，Tiam1，that encodes aproteinwith homology to GDP－GTP exchangers for Rho－like protein［J］．Cell，1994，77(4):537－549．

［2］Uozaki H，Horiuchi H，Ishida T，et al．Overexpression of resistance－related proteins(metallothioneins，glutathione－S－transferase pi，heat shock protein 27，and lung resistance－related protein)in osteosarcoma．Relationship with poor prognosis［J］．Cancer，1997，79(12):2336－2344．

［3］李新元，張建中．腫瘤侵襲誘導基因蛋白在正常及癌組織中的表達及意義［J］．中華病理學雜志，2000，29(4):294－295．

［4］Hou M，Tan L，Wang X，et al．Antisense Tiam1 down－regulates the invasiveness of 95D cells in vitro［J］．Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，2004，36(8):537－540．

［5］王會河，黃光武，林玲，等．Tiam1基因在喉癌中的表達與意義［J］．臨床檢驗雜志，2006，24(1):49－51．

［6］Etienne－Mannerille S，Hall A．RhoGTPases in cell biology［J］．Nature，2002，420(6916):629－635．

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R 730．264

B

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．028

2014－07－15;

2014－12－24)

(本文編輯:謝武英)

251700山東省濱州市中心醫院