四種香蘑屬真菌子實體抗氧化活性比較分析

李 凡，薛春梅，趙 曄，張躍華，李佳琳，杜春梅，趙永勛*

(1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)

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四種香蘑屬真菌子實體抗氧化活性比較分析

李 凡1，薛春梅1，趙 曄2，張躍華1，李佳琳1，杜春梅1，趙永勛1*

(1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)

[目的] 為了評價4種香蘑屬真菌的抗氧化活性。[方法] 對4種香蘑屬真菌子實體微波水提物進行抗氧化活性比較分析。[結果] 灰褐香蘑(Lepistaluscina)、白香蘑(Lepistacaespitosa)、紫丁香蘑(Lepistanuda)、花臉香蘑(Lepistasordida)4種香蘑子實體提取物對二苯基苦味酰基苯肼自由基(·DPPH)和羥自由基(·OH)的清除作用較顯著，對·DPPH的清除率依次達到73.9%、59.2%、80.7%和82.8%；對·OH的清除率分別達到92.5%、95.7%、83.6%和94.4%。這4種真菌子實體提取物對超氧陰離子亦有一定的清除作用。[結論]4種香蘑真菌子實體中可能存在著活性較強的天然抗氧化活性物質。

香蘑屬真菌; 抗氧化活性; DPPH; 羥自由基; 超氧陰離子

現代研究表明，許多疾病如心腦血管疾病、癌癥以及人體衰老等過程都與自由基過剩有關[1]。自由基是生物體內生物化學反應的普遍介質，是帶有不配對電子的原子、原子團或分子如羥自由基、超氧陰離子自由基等，可直接損傷各種生物膜，導致多種疾病的發生[2]。因而，如何開發利用抗氧化活性物質調節體內代謝、延緩衰老、預防疾病等問題已引起人們的廣泛關注。國內外的許多研究證明，很多大型真菌子實體和發酵產物中多含有抗氧化活性物質[3-6]。這表明大型真菌可能是提取天然、安全的抗氧化活性物質的理想原料。

香蘑屬(Lepista)真菌隸屬于真菌門(Eumycota)擔子菌綱(Basidiomysetes)傘菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomatceae)。我國已發現有12種[7]。到目前為止，關于香蘑屬真菌子實體提取物抗氧化活性的比較研究未見報道。筆者主要通過制備灰褐香蘑[Lepistaluscina(Fr.) Sing.]、白香蘑[Lepistacaespitosa(Bres.)Sing.]、紫丁香蘑[Lepistanuda(Bull.:Fr.)Cooke]、花臉香蘑[Lepistasordida(Fr.)Sing]等4種常見香蘑子實體提取物，測定其清除·DPPH、·OH以及超氧陰離子的能力，評價這4種香蘑屬真菌的抗氧化活性，并且進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑均為野生香蘑，采集于黑龍江省佳木斯市周邊林場。

1.2 提取液的制備[8]將采集的白香蘑、灰褐香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑放入干燥箱中烘干，準確稱取烘干后這4種香蘑各5.0 g，放入燒杯中，按料液比1∶20加雙蒸水至10.00 ml，用玻棒攪拌均勻，同時放入微波爐中，調至300 W輸出檔，定時1 min，取出，8 000 r/nmin離心4 min，取上清液，即為這4種香蘑的提取液。將這4種香蘑的提取液分別稀釋至0.5、1、2、4、6、8、10 mg/ml的濃度梯度，4 ℃冰箱保存，備用(保存時間最好不超過72 h)。

1.3 指標測定與方法

1.3.1清除·DPPH能力的測定[9]。精確稱取DPPH試劑0.015 8 g,用無水乙醇溶解，并定容至200.0 ml，使其濃度為200 μmol/L,避光保存(該溶液最好現配現用)。準確吸取各濃度樣品溶液2.0 ml與2.0 ml DPPH溶液,加入同一具塞試管中，充分混勻，37 ℃恒溫水浴暗反應30 min后，于波長517 nm處測定吸光度(Ai)，以無水乙醇調零。每個樣品平行測定3次，取平均值。按以下公式，計算各待測樣品對DPPH自由基的清除率。

式中，Ai為2.0ml樣品溶液與2.0mlDPPH試劑混合液的吸光度；Aj為2.0ml樣品溶液與2.0ml空白溶劑(無水乙醇)混合液的吸光度；Ao為2.0mlDPPH溶液與2.0ml溶劑混合液的吸光度。

1.3.2清除·OH能力的測定[10-12]。采取鄰二氮菲-Fe2+法測定羥基自由基的清除率。吸取 1.5 ml 5 mmol/L 鄰二氮菲應用液，加入4 ml pH 7.4磷酸鈉緩沖液，再加入1.0 ml 7.5 mmol/L FeSO4溶液，立即混勻。加入1 ml某一濃度的樣品溶液，立即混勻。加入 1.5 ml雙蒸水以補充體積，最后加入1.0 ml濃度1% H2O2溶液，以雙蒸水代替H2O2溶液作為空白對照，輕輕混勻。37 ℃保溫 90 min，于 536 nm測定吸光度。

·OH清除率計算公式為：

式中，Ai為加入樣品(子實體提取液)及H2O2；Aj為加H2O2而不加樣品；As為兩者都不加；Ao為空白對照。

1.3.3清除超氧陰離子(·O2-)能力的測定[10-12]。取pH為8.2的Tris-HCl緩沖液6.0 ml，加入不同濃度的樣品0.5 ml，37 ℃水浴 10 min，最后加入 37 ℃預熱過的7 mmol/L PR(鄰苯三酚鹽酸溶液 )1.0 ml，混勻后反應4 min，用0.5 ml濃鹽酸終止反應，測定325 nm處吸光度(A)以等體積pH為8.2的Tris-HCl緩沖液為空白吸光度(A0)。蒸餾水調零。

式中，A(試樣)為試樣組在波長325nm的吸光度；A0為空白組在波長325nm的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 ·DPPH清除率的比較對這4種香蘑屬真菌子實體的水提物清除·DPPH的能力進行雙因素方差分析。從圖1可以看出，這4種香蘑屬真菌子實體的水提物都有一定清除·DPPH的能力。在一定程度上，隨著子實體提取物濃度的增加，清除·DPPH的能力也在升高。當質量濃度為4.00 mg/ml時，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑和花臉香蘑的·DPPH清除率均達到較大值，分別為70.5%、58.6%、80.4%和80.5%。·DPPH去除能力強弱順序為花臉香蘑>紫丁香蘑>灰褐香蘑 >白香蘑。在0.50～4.00 mg/ml濃度梯度范圍內，·DPPH清除率隨著濃度的升高而增加。當質量濃度為6.00 mg/ml時，花臉香蘑的清除率最大，達到82.7%。在6.00～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內，隨著濃度的增加，4種香蘑的·DPPH清除率均有些許的降低。在0.50～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內，同種香蘑不同濃度梯度·DPPH清除率均有顯著差異。在提取物濃度相同的情況下，不同香蘑清除·DPPH能力之間存在差異，但白香蘑均與其他3種香蘑之間有顯著性差異。

2.2 清除·OH能力的比較從圖2可以看出，4種香蘑屬真菌子實體均有很強的清除·OH能力，在0.50～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內對·OH的清除能力均隨提取物質量濃度的增加而升高。當質量濃度為4.00 mg/ml時，去除能力強弱順序為花臉香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。當質量濃度為10 mg/ml時，白香蘑的清除率最大，達到94.9%。在提取物濃度相同的情況下，不同香蘑·OH的能力均存在差異，但白香蘑均與其他3種香蘑之間的清除率均有顯著差異。

2.3 清除超氧陰離子能力的比較由圖3可知，4種香蘑屬真菌子實體對鄰苯三酚自氧化均有抑制作用，在一定質量濃度范圍內對超氧陰離子的清除能力均隨提取物質量濃度的增加而升高。在所測樣品中，白香蘑具有較強的清除超氧陰離子的能力，并且隨著濃度的升高而增加。當質量濃度為4.00 mg/ml時，清除超氧陰離子能力的強弱順序為花臉香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。而當質量濃度為10.00 mg/ml時，白香蘑的清除率最高，達到25.4%。在0.50～4.00 mg/ml濃度梯度范圍內，各香蘑屬真菌間的清除率無顯著差異，但隨著質量濃度的升高，紫丁香蘑與其他3種香蘑的清除率均有顯著性差異。這可能與紫丁香蘑的藥用成分有關。

3 討論

目前，食品安全成為全世界關注的話題。人工合成抗氧化劑存在潛在的致癌作用，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業的發展趨勢[13]。傳統食用菌因含有多種抗氧化成分，受到人們的青睞，而對于那些珍惜的野生食用菌，科學家對其進行系統性抗氧化活性比較分析的研究較少。

研究表明，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑4種香蘑屬真菌子實體微波處理水提取物對·DPPH和·OH的清除作用比較顯著，其中對·DPPH的清除率分別達到73.0%、58.6%、80.0%和82.7%，花臉香蘑的清除能力最強；對·OH 的清除率分別達到91.0%、94.8%、82.3和90.3%，白香蘑的清除能力最強。4種香蘑屬真菌子實體的水提物對超氧陰離子均有一定的清除作用，分別達到17.3%、25.4%、14.8和17.5%，白香蘑的清除能力最強。這4種香蘑真菌子實體中可能存在著活性較強的天然抗氧化活性物質，推測其水提物中含有較多親水性抗氧化活性物質。該研究沒有對這4種香蘑屬真菌子實體中的抗氧化活性物質進行進一步的分離純化，所以不能確定抗氧化活性物質的具體成分，有待于今后進行深入研究。

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A Comparative Analysis on Antioxidant Activity for Four Kinds ofLepistaepiphyte

LI Fan1, XUE Chun-mei1, ZHAO Ye2, ZHAO Yong-xun1*et al

(1.College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007；2. Beijing Origin Water Membrane Technology Co. Ltd, Beijing 101407)

[Objective] The research aimed to evaluate the antioxidant activity of four kinds ofLepistaepiphyte. [Method] The comparative analysis for anti-oxidant activity of fungi microwave water extracts of the four fragrant mushroom fruiting bodies was carried out. [Result] Fungi microwave water extracts ofLepistaepiphyte,Lepistaluscina,Lepistacaespitosa,LepistanudaandLepistasordidashowed significant clearance ,which was 73.0%, 73.0%, 58.6% and 73.0% respectively to ·DPPH and 91.0%, 94.8%, 82.3% and 91.0% respectively to ·OH in the microwave processed water extract of their fruiting body. Moreover, the fruiting body extracts of the four kinds of fungus showed a clear effect on superoxide anion. [Conclusion] Fruiting body of four kinds ofLepistaepiphytemight contain natural antioxidant substances.

Lepistaepiphyte; Antioxidant activity; DPPH; Hydroxyl free radicals; Superoxide anion

黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目(12531696)。

李凡(1989-)，女，山東陽谷人，碩士研究生，研究方向：微生物學。*通訊作者，教授，碩士生導師，從事真菌生物化學方面的研究。

2014-12-15

S 646

A

0517-6611(2015)04-015-03