小黑楊PnsICE1基因的植物表達載體構建及遺傳轉化

王艷敏，張妍妍，白 卉

(1.黑龍江省林業科學研究所速生林木培育重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業科學院，黑龍江哈爾濱 150081)

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小黑楊PnsICE1基因的植物表達載體構建及遺傳轉化

王艷敏1，2，張妍妍1*，白 卉1*

(1.黑龍江省林業科學研究所速生林木培育重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業科學院，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的]構建PnsICE1基因的植物表達載體，并進行擬南芥遺傳轉化，以期為進一步研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。[方法]以pROKⅡ載體為骨架，利用In-Fusion連接方法構建由CaMV35S調控的小黑楊PnsICE1基因植物表達載體，用農桿菌介導法對擬南芥進行遺傳轉化。[結果]通過PCR檢測，結果證明PnsICE1基因已整合到擬南芥基因組中，獲得3株轉PnsICE1基因擬南芥。[結論]植物表達載體的構建及轉基因植株的獲得為研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。

小黑楊；PnsICE1；遺傳轉化

低溫傷害是世界上普遍存在的問題，也是造成農林業生產損失巨大的一種嚴重自然災害[1]。研究并提高植物耐寒能力具有重要的理論意義和現實意義。隨著生物技術的發展，導入外源基因提高植物抗逆性已成為現代植物育種的主要手段。ICE1(inducer of CBF expression1)也被稱為誘導CBF表達基因，是能夠調節冷誘導基因(cold-regulated，COR)表達的最上游轉錄因子。它編碼一個類似轉錄激活基因(MYC)的bHLH 轉錄因子，在常溫下鈍化，在低溫下能夠特異地結合CBF3啟動子中的MYC作用元件，誘導CBF3的表達，CBF3進一步結合到其下游目的基因啟動子的DRE序列，誘導下游一系列冷誘導基因以及其他在植物寒冷適應中起作用基因的表達，繼而提高轉基因植株的抗寒性[2-4]?，F已知轉ICE1基因的擬南芥、柑橘、甜楊、蘋果、大花蕙蘭、水稻、煙草與非轉基因植株相比，抗寒性都得到了提高[5-18]。筆者利用In-Fusion連接方法構建小黑楊PnsICE1基因植物表達載體，并轉化擬南芥，獲得T3代轉基因擬南芥，為進一步研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)：生態型Columbia(Col-0)，種植于人工土(黑土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶2∶1)中。

菌株與載體：大腸桿菌感受態(Esherichiacoli)Top10 購自北京原平皓生物技術有限公司。根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由黑龍江省林業科學研究所速生林木培育重點驗室保存。pROKⅡ Vector 由山東農業大學惠贈。

高效連接試劑盒In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit、T4DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture、DNA分子量標準DL-2000均購自TaKaRa公司。

限制性內切酶均購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司公司(Promega, http://www.promega.com/)。

抗生素：利福平(Rifampicin，Rif)、羧芐青霉素(Carbenicillin, Cab)、乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)購自北京國藥化學試劑有限公司(http://www.crc-bj.com/)，卡那霉素(Kanamycin，Kan)和氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購自Sigma公司。

所用引物及測序委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成及完成(Sangon，http://www.sangon.biogo.net/)，引物序列：PnsICE1-OE F：5′-TCGAGCTCGGTACCCATGCTTTATAGACTCAATAGC-3′；PnsICE1-OE R：5′-CTCTAGAGGATCCCCCTACATCGCGCCATGGAAGCC-3′；pROKⅡ F：5′-GGCGAACGTGGCGAGAAAGG-3′；pROKⅡ R：5′-ACAGGTT-TCCCGACTGGAAAGC-3′。

1.2 PnsICE1基因植物表達載體構建以之前獲得的陽性克隆pMD18-T-PnsICE1質粒為模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R為引物(下劃線為引入pROKⅡ同源互補序列)，利用PCR方法引入pROKⅡ質粒線性化末端的同源互補序列。PCR 擴增體系：DNA 2.0 μl，10×ExTaqPCR buffer2.0 μl，10 mmol/L dNTP Mix 0.4 μl，10 μmol/L引物各1.0 μl，5 U/μl ExTaq0.2 μl，補水至20.0 μl。PCR反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性 10 s、58 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸2 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μl PCR產物進行電泳檢測，以DL2000 DNA Marker 為參照?；厥誔CR產物，用限制性內切酶SmaI對pROKⅡ vector進行單酶切。將目的基因(PnsICE1)片段與pROKⅡ vector的連接反應連接產物轉化大腸桿菌，陽性克隆PCR檢測。挑取陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序成功的重組質粒轉化農桿菌，進行農桿菌菌液檢測。

1.3 浸花法轉化擬南芥采用蘸花法進行擬南芥的遺傳轉化[14]，將盛花期的擬南芥的花序浸泡在含有過表達質粒農桿菌的浸染液中[3%蔗糖、150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養基(pH5.8)，OD600≈ 0.2]10 s，期間輕輕搖動，取出后室溫放置10 min，再侵染一次。侵染過的植株需保濕，48 h后用水噴霧將轉化植株徹底清洗一次。21～28 d收集種子，加入適量變色硅膠保持干燥。標記為T0代，4 ℃保存。轉基因擬南芥的T0代種子表面消毒后鋪于含50mg/L Kan的篩選培養基上進行逐代篩選，直至獲得T3代種子，利用pROKⅡ載體引物對篩選出的抗性苗進行PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 PnsICE1基因植物表達載體構建以之前獲得的陽性克隆pMD18-T-PnsICE1質粒為模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R為引物，利用PCR的方法引入pROKⅡ質粒線性化末端的同源互補序列(圖1A)。提取pROKⅡ質粒(圖1B)，用限制性內切酶SmaⅠ 對pROKⅡ vector進行單酶切(圖1C)利用In-Fusion連接方法將質粒與目的片段相連接，將連接產物轉化大腸桿菌感受態，挑取3個單克隆進行初步的菌液PCR檢測，獲得一個陽性轉化子，目的條帶為1 600 bp左右(圖1D)，將通過菌落PCR驗證目的片段正確的一個單克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，經序列比對成功后，提取陽性質粒。將陽性質粒轉化農桿菌，挑取5個單克隆將農桿菌菌液進行PCR檢測，結果顯示均為陽性轉化子(圖1E)，保存菌種，用于下一步的擬南芥遺傳轉化。

2.2 PnsICE1基因過表達植物的鑒定轉基因擬南芥的T0代種子表面消毒后鋪于含50 mg/L Kan的篩選培養基上(圖2A),進行逐代篩選，直至獲得T3代轉基因擬南芥(圖2B)，利用pROKⅡ載體引物對篩選出的抗性苗進行PCR檢測(圖3)，獲得的3株轉基因擬南芥均獲得與陽性對照相同目的條帶，而野生型對照植株未檢測到目的條帶，初步說明PnsICE1基因已整合到擬南芥基因組中。

3 討論

構建林木重要基因植物表達載體并獲得過表達植株繼而研究其功能，對于闡明多年生木本植物抗寒調控的分子機制具有重要的理論意義。研究表明，植物ICEI轉錄因子在常溫下鈍化，在低溫下能夠特異地結合CBF3啟動子中的MYC作用元件，誘導CBF3的表達，CBF3進一步結合到其下游目的基因啟動子的DRE序列，從而誘導下游一系列冷誘導基因以及其他在植物寒冷適應中起作用的基因的表達，繼而提高轉基因植株的抗寒性[2-4]。該研究將之前從小黑楊中獲得的pnSICE1基因利用In-Fusion連接方法成功構建植物過表達載體，并轉化擬南芥，成功獲得3株T3代轉基因擬南芥，為進一步研究小黑楊PnsICE1基因功能、PnsICE1轉錄因子調控機制提供材料。

[1] PEARCE R S.Molecular analysis of acclimation to cold[J].Plant Growth Regul,1999,29(1/2):47-76.

[2] CHINNUSAMY V,OHTA M,KANRAR S,et al.ICE1：a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabiopsis[J].Genes Development,2003,17(8)：1043-1054.

[3] LEE B,HENDERSON D A,ZHU J K.TheArabidopsiscold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1[J].Plant Cell,2005,17:3155-3175.

[4] BADAWI M,REDDY Y V, AGHARBAOUI Z,et al .Structure and functional analysis of wheat ice (Inducer of CBF Expression) genes[J].Plant& Cell Physiology,2008 ,49(8):1237-1249.

[5] 張瑜,向殿軍,殷奎德.農桿菌介導的大花蕙蘭轉ICE1基因[J].中國農學通報,2008,24(12)：40-43.

[6] 向殿軍,滿麗莉,殷奎德.擬南芥ICE1基因轉化水稻的進一步研究[J].生物技術通報,2008(6)：87-90,96.

[7] 鄭銀英,崔百明,常明進,等.轉擬南芥ICE1基因增強煙草抗寒性的研究[J].西北植物學報，2009，29(1)：75-79.

[8] 黃家權.抗寒基因的克隆及根癌農桿菌介導的ICE1基因轉化柑橘的研究[D].武漢：華中農業大學，2005.

[9] 林元震,張志毅,劉純鑫，等.甜楊抗凍轉錄因子ICE1基因的in silico克隆及其分析[J].分子植物育種,2007，5(3)：424-430.

[10] 趙玲玲.蘋果MdSAMDC2和MdICE1基因的功能鑒定以及抗逆性研究[D].泰安：山東農業大學，2007.

[11] 軒春雷,肖向文,李曉波，等.鹽芥ICE1轉錄因子的克隆及生物信息學分析[J].生物技術通報,2010(11):108-114.

[12] XU W R ,JIAO Y T,LI R M,et al .Chinese wild-growingVitisamurensisICE1 and ICE2 encode MYC-type bHLH transcription activators that regulate cold tolerance in arabidopsis[J].Plos One,2014,9(7):1-12.

[13] DONG C,ZHANG Z,REN J, et al.Stress-responsive gene ICE1 fromVitisamurensisincreases cold tolerance in tobacco[J].Plant Physiology and Biochemistry,2013,71:212-217.

[14] CLOUGH S J，BENT A F.Floral dip.A simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].Plant,1998,16:735-743.

[15] CHEN L,CHEN Y,JIANG J,et al.The constitutive expression ofChrysanthemumdichrumICE1 inChrysanthemumgrandiflorumimproves the level of low temperature,salinity and drought tolerance[J].Plant Cell Reports,2012,31(9):1747-1758.

[16] FENG H L,MA N N,MENG X,et al.A novel tomato MYC-type ICE1-like transcription factor,SlICE1a,confers cold,osmotic and salt tolerance in transgenic tobacco[J].Plant Physiology and Biochemistry,2013,73:309-320.

[17] MIURA K,JIN J B,LEE J,et al .SIZ1-mediated sumoylation of ICE1 controls CBF3/DREB1A expression and freezing tolerance in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2007,19(4):1403-1414.

[18] XU W,JIAO Y,LI R,et al .Chinese wild-growingVitisamurensisICE1 and ICE2 encode MYC-type bHLH transcription activators that regulate cold tolerance inArabidopsis[J].Plos One,2014,9(7):102303.

Construction of Plant Expression Vector ofPnsICE1 Gene inPopulussimonii×P.nigraand Transformation

WANG Yan-min1,2, ZHANG Yan-yan1*, BAI Hui1*

(1. Key Laboratory of Fast Growing Forest Cultivation, Forestry Science Research Institute of Heilongjiang Province, Harbin, Heilongjiang 150081; 2. Heilongjiang Forestry Academy of Science, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] The goal of this study was to structure the plant expression vector ofPnsICE1 and genetic transformation inArabidopsisthaliana, in order to provide the data of further study onPnsICE1. [Method] Based on the pROKⅡ vector, the plant expression vector ofPnsICE1 was constructed by the in-fusion method of attachment, in the vector,PnsICE1 gene was driven by promoterCaMV35S.PnsICE1 gene was transformed intoArabidopsisthalianavia Agrobacterium-mediated method. [Result] PCR detection indicated that the PnsICE1 was successfully integrated intoArabidopsisthalianagenome. [Conclusion] Construction of plant expression vector and acquisition of the transgenic plant in this study might be useful on study ofPnsICE1 gene function.

Populussimonii×P.nigra;PnsICE1; Transformation

黑龍江省省屬科研院所基本科研業務費專項“小黑楊抗寒轉錄因子ICE1基因及啟動子的克隆與功能分析”；黑龍江省科研機構創新能力提升專項計劃項目(YC2014D005)；黑龍江省森工總局青年基金項目(sgzjQ2014007)；黑龍江省林業科學院青年基金項目(201411)。

王艷敏(1981-)，女，吉林鎮賚人，助理研究員，博士，從事林木遺傳育種工作。*通訊作者，張妍妍，助理研究員，從事森林培育工作。*通訊作者，白卉，副研究員，從事林木遺傳育種工作。

2014-12-12

S 181.3;Q 782

A

0517-6611(2015)04-047-03