紅外指紋圖譜和聚類分析法在山銀花(華南忍冬)產(chǎn)域分類鑒別中的應(yīng)用

田建平，張名楠，陳國良，張吉貞，胡遠(yuǎn)艷*

(1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南海口 571199；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228；3.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南海口 570228)

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紅外指紋圖譜和聚類分析法在山銀花(華南忍冬)產(chǎn)域分類鑒別中的應(yīng)用

田建平1，張名楠2，陳國良2，張吉貞3，胡遠(yuǎn)艷3*

(1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南海口 571199；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228；3.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南海口 570228)

[目的]研究紅外指紋圖譜在山銀花產(chǎn)域鑒別中的可行性。[方法]以山銀花(華南忍冬)的紅外指紋圖譜(紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜)為依據(jù)，采用聚類分析對來自6個產(chǎn)地(海南和廣東)的華南忍冬進(jìn)行了分析。[結(jié)果]藥材粉末的一維紅外光譜分析表明，海口、湛江和韶關(guān)3個產(chǎn)地與其他3個產(chǎn)地(文昌、瓊中、屯昌)在某些化學(xué)成分方面有著較顯著的差異，表現(xiàn)為湛江區(qū)具有3 407 cm-1特征吸收峰，韶關(guān)區(qū)具有1 637 cm-1特征吸收峰，第3號海口區(qū)和韶關(guān)區(qū)分別為具有1 066、1 074 cm-1特征吸收峰，海口、湛江和韶關(guān)區(qū)具有611、610和 615 cm-1特征吸收峰；而另外3個地域(文昌、瓊中和屯昌)的華南忍冬化學(xué)成分則較相似；根據(jù)聚類分析結(jié)果可將6個產(chǎn)地分為四類。[結(jié)論]紅外光譜可為藥材的質(zhì)量控制和產(chǎn)區(qū)鑒別提供一個快捷、準(zhǔn)確、可行的鑒別方法。

紅外光譜；聚類分析；二階導(dǎo)數(shù)圖譜；產(chǎn)域鑒別；山銀花

華南忍冬[Loniceraconfusa(Sweet)DC.]為忍冬科多年生藤本植物，主要分布在廣東、廣西、海南等地，花蕾或剛開放的花供藥用，為華南地區(qū)“山銀花”中藥材的主要基源之一[1]。華南忍冬所含化學(xué)成分較多，如有機酸(綠原酸、異綠原酸、咖啡酸)、棕櫚酸等揮發(fā)油成分、黃酮類化合物、三萜皂苷類化合物。由于受地理生態(tài)和種質(zhì)遺傳等多方面因素的影響，不同產(chǎn)區(qū)華南忍冬的化學(xué)組成也不盡相同，最終致使其具有不同的藥效和藥性。因此，有必要對藥材產(chǎn)區(qū)進(jìn)行鑒別以便于對藥材市場進(jìn)行質(zhì)量控制，同時提高藥材的質(zhì)量。紅外光譜具有分析速度快、多種成分同時分析、無污染的優(yōu)點，其樣品不需特別的預(yù)處理，無損傷分析、操作簡單、分析成本低，因此是一種重要的分析技術(shù)。 近年來紅外光譜技術(shù)已在中藥材鑒定、 中藥材炮制、中藥注射劑等相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2-6]。目前，有關(guān)不同產(chǎn)地華南忍冬中綠原酸和總黃酮含量測定的研究較多，但僅用較單一性指標(biāo)成分還不足以區(qū)分和鑒別華南忍冬的產(chǎn)區(qū)和質(zhì)量[7-9]。該研究擬借助于紅外光譜的指紋特性，用聚類分析法對產(chǎn)于海南和廣東的華南忍冬進(jìn)行產(chǎn)區(qū)聚類，探討其在分析、鑒別華南忍冬不同產(chǎn)區(qū)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料于2013年期間分別從海南(海口、文昌、屯昌和瓊中)、廣東(湛江和韶關(guān))等地進(jìn)行山銀花藥材樣品采集，樣品由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊衛(wèi)麗副教授鑒定為山銀花，其基源為來自忍冬科植物華南忍冬[Loniceraconfusa(Sweet)DC.]的干燥花蕾或剛開放的花。 憑證標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院中藥標(biāo)本館。冷凍干燥后藥材經(jīng)過粉碎機粉碎，過100目篩備用。

1.2 儀器紅外光譜特征比較研究所用儀器為粉末壓片機769YP-15A(中國)；紅外光譜儀Bruker TGA-IR(德國)。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品處理。取冷凍干燥后恒重的山銀花藥材粉末約3 mg，與200 mg 溴化鉀(優(yōu)級品)混合研磨均勻，利用粉末壓片機壓片。

1.3.2紅外光譜分析。試驗研究所用檢測器分辨率為4 cm-1；檢測范圍4 000～400 cm-1；掃描信號累加 16 次，OPD速度為 0.2 cm/s；掃描時實時扣除水和二氧化碳的干擾。放入KBr壓片樣品之前，掃描紅外光譜儀聯(lián)用軟件“背景單通道”；放入KBr壓片樣品后，掃描“樣品單通道”，然后通過基線校正，13點平滑，獲取其紅外光譜原始圖，并標(biāo)峰。每樣品連續(xù)測定3次。利用OMNIC 8.0軟件數(shù)據(jù)處理導(dǎo)數(shù)圖譜功能，13點平滑，求得其二階導(dǎo)圖譜(600～1 750 cm-1)。

1.3.3聚類分析。根據(jù)相應(yīng)波數(shù)位置光譜峰的有無，對山銀花藥材的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼，對相應(yīng)位置沒有紅外峰編碼為“0”，有紅外峰則編碼為“1”，然后利用 SPSS13.0軟件的類間平均鏈鎖方法(Between Group Linkage)對其進(jìn)行聚類分析，二值歐氏距離平方(Binary Squared Euclidean Distance)測度方法計算其相似性，并構(gòu)建不同產(chǎn)地山銀花藥材聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于一維紅外光譜的不同產(chǎn)地山銀花的比較通過傅立葉變換紅外光譜測定法獲得了山銀花(華南忍冬)入藥部位的一維紅外光譜圖，由來自不同產(chǎn)地的山銀花(華南忍冬)入藥部位紅外光譜分層圖(圖1)可知，不同產(chǎn)區(qū)的山銀花(華南忍冬)入藥部位的一維紅外光譜圖整體上較相似，其共同吸收波數(shù)為2 922～2 927、2 853～2 857、1 378～1 383、1 315～1 318、1 259～1 262 cm-1；不同之處在于湛江區(qū)具有3 407 cm-1波數(shù)，其他5個產(chǎn)區(qū)位于3 417～3 424 cm-1；韶關(guān)區(qū)具有1 637 cm-1波數(shù)，其他5個產(chǎn)區(qū)位于1 631～1 632 cm-1，海口區(qū)和韶關(guān)區(qū)分別為1 066、1 074 cm-1波數(shù)，其他4個產(chǎn)區(qū)位于1 050～1 054 cm-1；另外海口、湛江和韶關(guān)區(qū)具有611、610和 615 cm-1波數(shù)，其他3個產(chǎn)區(qū)位于602～603 cm-1，說明不同產(chǎn)區(qū)的同一種山銀花藥材其化學(xué)成分存在差異。

結(jié)合有關(guān)資料，通過對圖1的譜帶所對應(yīng)的官能團進(jìn)行歸屬和分析后發(fā)現(xiàn)，2 922～2 927 cm-1波數(shù)附近存在-C-CH2-C不對稱-C-H伸縮的吸收峰，2 853～2 857 cm-1波數(shù)附近存在-CH2烷鍵對稱伸縮的吸收峰，有可能是多糖、蛋白質(zhì)和脂類化合物等；1 631～1 632 cm-1波數(shù)附近存在黃酮等化合物中的不飽和C-C鍵的吸收峰，1 378～1 383 cm-1波數(shù)存在-CH3吸收峰；1 315～1 318 cm-1波數(shù)附近存在-OH面內(nèi)變形振動的吸收峰，1 153～1 158 cm-1波數(shù)附近存在胺類物質(zhì)中C-N伸縮振動與醇類或酚類物質(zhì)中C-O單鍵伸縮振動的吸收峰等；610 cm-1波數(shù)附近可能存在芳香類化合物中C-H面外彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰。由該紅外光譜可說明所在樣品里可能含有酚類、醇類、黃酮類、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。

2.2 基于二階紅外光譜的不同產(chǎn)地山銀花的比較及聚類分析利用OMNIC 8.0軟件對紅外導(dǎo)數(shù)圖譜功能，得到了不同產(chǎn)區(qū)山銀花的二階導(dǎo)數(shù)圖譜(600～1 750 cm-1)(圖2)。由圖2可知，6種來自不同產(chǎn)區(qū)的山銀花(華南忍冬)藥材的紅外光譜經(jīng)轉(zhuǎn)換為二階導(dǎo)數(shù)圖譜后，其重疊的吸收峰被分開，但其中絕大部分峰仍然相似，表明它們是來自同一種植物，但在某些峰方面也存在顯著差別，如廣東湛江區(qū)具有1 582 cm-1波數(shù)，其他5個產(chǎn)區(qū)均為1 568～1 569 cm-1；廣東韶關(guān)區(qū)具有1 044和1 188 cm-1波數(shù)，其他5個產(chǎn)區(qū)則無該波數(shù)。因此說明來自不同地域的山銀花(華南忍冬)其化學(xué)成分存在一定差異。進(jìn)一步根據(jù)其光譜特征利用SPSS統(tǒng)計軟件做聚類分析，得到不同產(chǎn)區(qū)山銀花聚類分析圖(圖3)，可以將6個產(chǎn)區(qū)分為4組，進(jìn)一步證實了上述結(jié)論，因此可以根據(jù)紅外光譜特征區(qū)別山銀花(華南忍冬)的不同產(chǎn)區(qū)。

3 結(jié)論與討論

直接測定相關(guān)材料粉末的紅外光譜，所獲得的譜圖是各化合物吸收強度的疊加，與總體成分有關(guān)，具有指紋性。借助該指紋圖譜，可利用相關(guān)方法對其產(chǎn)區(qū)進(jìn)行聚類和鑒別。現(xiàn)有報道已說明紅外圖譜在對藥材所含的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別時所具有的多方面的優(yōu)點[2-3]。該研究通過對不同產(chǎn)地山銀花(華南忍冬)的藥材進(jìn)行紅外光譜分析，其一維紅外光譜鑒定結(jié)果呈現(xiàn)了海南海口區(qū)、廣東湛江區(qū)和韶關(guān)區(qū)均有較特殊的波數(shù)，在二階導(dǎo)數(shù)譜圖中，特別是在1 600～1 000

cm-1波數(shù)范圍內(nèi)差異較明顯，這種結(jié)果可能與不同產(chǎn)區(qū)所在的地理環(huán)境不同，特別是海口、湛江等地具有特殊的火山巖等土壤有關(guān)，因此可利用紅外光譜特點，根據(jù)其具體吸收峰的位置將6種產(chǎn)地的山銀花(華南忍冬)區(qū)分為4組，也進(jìn)一步證實了利用紅外光譜技術(shù)和聚類分析可為藥材的質(zhì)量控制和產(chǎn)區(qū)鑒別提供一個快捷、準(zhǔn)確、可行的鑒別方法。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典.一部(2010 版)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 郭水良，李沛玲，方芳，等.蛇足石杉及其近緣種表征關(guān)系的 FTIR主成分分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2005，25(5)：693-697.

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The Application in Identification and Classification in Production Domain of Lonicerae Flos by Using FTIR Fingerprint and Cluster Analysis

TIAN Jian-ping1, ZHANG Ming-nan2,CHEN Guo-liang2,HU Yuan-yan3*et al

(1.Department of Paharmacy,Hainan Medical College,Haikou,Hainan 571199;2.Materials and Chemical Engineering,Hainan University, Haikou,Hainan 570228;3.Key Laboratory for Tropical Biological Resources,MOE,Hainan University,Haikou,Hainan 570228)

[Objective]The research aimed to study the feasibility in identification on region of Lonicerae Flos by using FTIR fingerprint methods.[Method]According to the FTIR fingerprint of Lonicerae Flos(Loniceraconfusa) including infrared spectroscopy and second derivative spectrum,the samples of medicinal materials from six areas both Hainan and Guangdong province had been analyzed by using cluster analysis methods.[Result]One dimensional infrared spectroscopy analysis of medicinal materials power showed that three areas (Haikou,Zhanjiang,Shaoguan) had more differences in chemical composition among of all areas.And the Zhanjiang with 3 407 cm-1, Shaoguan with 1 637 cm-1, Haikou and Shaoguan, respectively, for the 1 066 cm-1and 1 074 cm-1, also the Haikou,Zhanjiang and Shaoguan with 611, 610 and 615 cm-1. While the other three regions were similar to each other in chemical composition.According to the results of cluster analysis of six areas could be divided into four categories.[Conclusion]Infrared spectroscopy could provide a fast, accurate and feasible method for the identification of medicinal materials quality control and identifying regions.

FTIR;Cluster analysis;Second derivative spectrum;Regions identification;Lonicerae Flos

海南省教育廳科學(xué)基金資助項目(Hjkj2012-29)。

田建平(1972- )，男，湖南常德人，副教授，博士，從事中藥資源學(xué)研究。*通訊作者，高級實驗師，碩士，從事中藥及藥理學(xué)研究。

2014-12-16

S 567

A

0517-6611(2015)04-112-03