改良的苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖含量

陰婉婷， 李 彤， 馬 辰

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050)

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改良的苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖含量

陰婉婷， 李 彤*， 馬 辰

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050)

[目的]改良苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖含量。[方法]采用水提醇沉法制備多糖沉淀并溶解成供試品溶液。精密量取供試品溶液和葡萄糖對照溶液各1.0 ml，分別置10 ml具塞試管中，加1.0 ml水，緩慢加入7.0 ml濃硫酸，搖勻，恒溫放置1 h，加入1.0 ml 4%苯酚溶液，搖勻，40 ℃水浴35 min后冰水浴5 min，取出放置20 min，在487 nm處測定吸光度，計算多糖含量。[結果]該方法在10.26～102.55 μg葡萄糖的回歸方程為Y=0.013 9X+0.007(r=0.999 9)；平均回收率為97.7%(RSD=2.3%)，精密度試驗和重復性試驗的RSD分別為1.4%和2.7%。不同來源蛹蟲草多糖含量在1.21%～4.70%。[結論]該方法顯色穩定、準確可靠、重復性好、靈敏度高，可測定蛹蟲草多糖含量并為蛹蟲草質量研究提供依據。

蛹蟲草；多糖；苯酚-硫酸法；含量測定

蛹蟲草(CordycepsmilitarisLink)，別名北冬蟲夏草、北蟲草。蛹蟲草化學成分與冬蟲夏草相似，含有蟲草素、蟲草酸、多糖等有效成分，以及多種對人體有益的物質，如氨基酸、維生素、無機元素和超氧化物歧化酶(SOD)等，其中，蟲草素和SOD在蛹蟲草中的含量高于冬蟲夏草，無機元素種類與冬蟲夏草基本一致且含量豐富。蛹蟲草能夠降低血脂，保護心、腦組織，同時，具有調節免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤的作用，且安全無毒，可以作為冬蟲夏草的代用品[1]。蛹蟲草在新藥研究和保健品開發方面有重大價值，且人工栽培已獲成功，其質量控制是必不可少的內容。由于蟲草多糖有廣泛的生物活性[2]，如抗腫瘤、降血糖、抗氧化，且蛹蟲草的免疫調節作用也主要與蟲草多糖有關，因此，測定蟲草多糖含量可以為蛹蟲草質量控制提供依據。苯酚-硫酸法是測定多糖含量的經典方法之一[3-4]，但對顯色條件的要求較為嚴格[4]，操作難度較大，筆者通過改變顯色劑苯酚與濃硫酸的加入順序，顯著提高了蛹蟲草多糖含量測定方法的穩定性、可操作性和檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器。He λ ios α紫外-可見分光光度計(Thermo Spectronic)；RE-52AA水浴鍋(上海振捷實驗設備有限公司)；XMTD-6000水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；XP205型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；CP224S型電子天平(德國賽多利斯公司)；DT5-2型低速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司，上海益恒實驗儀器有限公司)。

1.1.2試劑。硫酸(北京化工廠)，苯酚(北京化學試劑二廠)，葡萄糖(北京化學試劑公司)，無水乙醇(北京化工廠)，以上試劑均為分析純；娃哈哈純凈水。

1.1.3蛹蟲草樣品。由不同生產廠家提供，分別編號為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8。

1.2 方法

1.2.1對照品溶液的制備。取葡萄糖適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取5 ml對照品儲備液置25 ml量瓶，加水稀釋制成每1 ml含40 μg葡萄糖的對照品溶液。

1.2.2供試品溶液的制備。蛹蟲草樣品在60 ℃下干燥12 h，粉碎，過60目篩。取樣品約0.5 g，精密稱定，加入純凈水50 ml，稱重。90 ℃水浴回流提取2 h，冷卻后補重。4 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 ml，加入無水乙醇8 ml，冰箱冷藏48 h，沉淀多糖。4 000 r/min離心90 min，傾出上清液，其沉淀用水溶解，定量轉移至5 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，作為樣品儲備溶液。測定其吸光度后，將其稀釋制成適當濃度的樣品溶液以備測定，或將同法制得的沉淀定量轉移至適當容積的量瓶中，制成濃度合適的供試品溶液。

1.2.3測定波長的選擇。精密量取葡萄糖對照溶液1.0 ml置10 ml具塞試管中，加1.0 ml水，緩慢加入7.0 ml濃硫酸，搖勻，恒溫放置1 h，加入4%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，40 ℃水浴35 min后冰水浴5 min，取出放置20 min。另取2.0 ml水，置10 ml具塞試管中，自“緩慢加入7.0 ml濃硫酸”起，同上平行操作，作為空白對照。于200～700 nm掃描，以最大吸收波長為測定波長。

1.2.4顯色條件的優化。按照“1.2.3”項的顯色及測定條件，進行單因素試驗，分別優化各顯色條件。①加入不同體積苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml；②分別加入濃硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml；③加入濃硫酸后放置不同時間10、20、30、45、60、120、180 min；④加入濃硫酸后，反應溫度分別為10、20、25、30 ℃；⑤加入苯酚后，分別在20、40、60、80 ℃溫度下顯色35 min;⑥加入苯酚后，于40 ℃分別顯色15、20、25、30、35、40、45 min。測定各顯色條件下的吸光度，確定最佳顯色條件。

1.2.5方法學考察。

1.2.5.1標準曲線的繪制。精密量取對照品儲備液適量，加水分別稀釋成10、20、40、60、80、100 mg/L葡萄糖溶液，精密量取上述葡萄糖溶液各1.0 ml，置10 ml具塞試管中，在最佳條件下顯色并測定吸光度。以葡萄糖質量(μg)為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5.2精密度試驗。將樣品1多糖沉淀定量轉移至25 ml量瓶，加水溶解并定容、搖勻，制得供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 ml，在最佳條件下顯色并測定吸光度，平行測定6次。

1.2.5.3穩定性試驗。精密量取“1.2.5.2”項供試品溶液1.0 ml，在最佳條件下顯色并測定吸光度，每5 min測定一次，連續測定2 h。

1.2.5.4回收率試驗。精密量取“1.2.5.2”項供試品溶液0.5 ml置10 ml具塞試管中，低、中、高濃度組分別精密加入葡萄糖對照品溶液適量，每組平行3份，加水至2 ml。在最佳條件下顯色并測定吸光度，計算回收率。

1.2.5.5重復性試驗。取6份樣品1各0.5 g，精密稱定，按照“1.2.2”項方法制備供試品溶液，在最佳條件下顯色并測定吸光度，計算多糖含量及RSD。

1.2.6蛹蟲草樣品多糖含量測定。按照“1.2.2”項方法分別制備蛹蟲草樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8的供試品溶液(n=3)，在最佳條件下顯色并測定吸光度，計算多糖含量。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇按照“1.2.3”項方法顯色并掃描200～700 nm的吸光度，在487 nm處有最大吸收，確定487 nm為測定波長。

2.2 顯色條件的優化

2.2.1苯酚用量的選擇。加入苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml時的吸光度分別為0.433、0.504、0.530、0.541、0.543。吸光度隨苯酚用量增加而增加，用量1.0 ml與1.2 ml的吸光度變化不大，確定1.0 ml為苯酚用量。

2.2.2濃硫酸用量的選擇。加入濃硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml時的吸光度分別為0.190、0.346、0.474、0.588、0.525。加入7.0 ml濃硫酸時吸光度最大，確定7.0 ml為濃硫酸用量。

2.2.3加入硫酸后放置時間的考察。加入濃硫酸后分別放置10、20、30、45、60、120、180 min，吸光度分別為0.468、0.512、0.525、0.538、0.546、0.551、0.560。吸光度在60 min后基本不變，確定放置60 min。

2.2.4加入硫酸后放置溫度的考察。加入濃硫酸后于10、20、25、30 ℃放置，吸光度分別為0.567、0.531、0.524、0.488。可見吸光度隨放置溫度的升高而降低，故應保持放置中溫度的恒定。

2.2.5顯色溫度的選擇。加入苯酚后，分別在20、40、60、80 ℃溫度下顯色35 min，測得吸光度分別為0.537、0.589、0.546、0.481。在40 ℃時吸光度最高且穩定，確定40 ℃為顯色溫度。

2.2.6顯色時間的選擇。加入苯酚后，分別考察40 ℃顯色15、20、25、30、35、40、45 min的吸光度，結果表明，35 min后，吸光度穩定，確定顯色時間為35 min。

2.3 方法學考察以葡萄糖質量(μg)為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.013 9X+0.007(r=0.999 9)，表明葡萄糖在10.26～102.55 μg線性關系良好。供試品溶液平行測定6次，RSD=1.4%，表明精密度良好。顯色后溶液在2 h內吸光度穩定，平均回收率為97.7%，RSD為2.3%(表1)，表明回收率滿足要求。樣品1多糖含量RSD為2.7%(n=6)，表明重復性良好。

表1 回收率試驗結果

2.4 蛹蟲草樣品多糖含量經測定，蛹蟲草樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8的多糖含量分別是3.21%、3.68%、2.03%、2.59%、1.96%、1.21%、1.23%和4.70%。

3 討論

按照標準的多糖含量測定方法[3]，精密量取40 mg/L葡萄糖對照溶液1.0 ml，先加入適量苯酚溶液(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 ml)，后加入濃硫酸混勻，分別測定吸光度。吸光度隨苯酚用量增加而增加，且變化較大，表明苯酚溶液量的較小變化會對吸光度產生較大影響。苯酚-硫酸法測定多糖含量的機制是多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水，生成糠醛衍生物，進而與苯酚縮合成有色化合物。由于苯酚含有強致活基團酚羥基，很容易與濃硫酸發生磺化反應[5]，推測濃硫酸與糠醛衍生物競爭苯酚。該試驗改變顯色劑濃硫酸和苯酚的加入順序：先向糖溶液中加入濃硫酸，充分生成糠醛衍生物，再加入苯酚溶液，產物穩定。結果表明，改良后的方法靈敏度顯著提高，測定方法重現性好。

該試驗研究過程中發現經典的苯酚-硫酸法對各個顯色條件要求均較為嚴格，若達不到要求，會影響結果的重復性，所以，該方法操作難度較大，與紀寶玉等報道[4]一致。改良后的方法，使每一步反應完全，吸光度較為穩定，易于得到良好的精密度和重復性，因此，改良后的方法對放置時間和顯色時間的要求較為寬松，這使方法的可操作性大大提高。

改良后的苯酚-硫酸法顯色穩定，精密、準確，重現性好，且靈敏度顯著提高，這有利于低濃度供試品溶液的分析，擴大了可分析的樣品范圍。該方法可用于蛹蟲草多糖含量的測定。

[1] 王建芳，楊春清.蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進展[J].中醫藥信息，2005，22(5)：30-32.

[2] 王普，鄭明，何軍邀，等.蟲草多糖的化學結構及藥理活性研究進展[J].浙江工業大學學報，2010，38(2)：129-133，172.

[3] 中華人民共和國農業部.中華人民共和國農業行業標準 食用菌中粗多糖含量的測定 NY/T 1676-2008[S].北京：中國農業出版社，2008.

[4] 紀寶玉，裴莉昕，陳隨清，等.葛根不同生長期多糖含量的動態積累研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(16)：63-65.

[5] 邢其毅，裴偉偉，徐瑞秋，等.基礎有機化學，下冊[M].3版.北京：高等教育出版社，2005:837.

Determination of Polysaccharides inCordycepsmilitarisLink by Improved Phenol-sulfuric Acid Method

YIN Wan-ting, LI Tong*, MA Chen

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)

[Objective] To determine polysaccharides inCordycepsmilitarisLink by improved phenol-sulfuric acid method. [Method] Prepare polysaccharides by water-extraction and alcohol-precipitation method and dissolve the polysaccharides in water to obtain the sample solution. Transfer accurately measured 1.0 ml of sample solution and glucose reference solution to 10 ml volumetric test tubes, respectively. To each tube, add 1.0 ml of water and slowly add 7.0 ml of sulfuric acid with the stream of acid being directed against the tube wall and shake each tube immediately upside down, then allow it to stand for 1 h at constant temperature. Add 1.0 ml of 4% phenol aqueous solution and shake and keep every tube in water bath at 40 ℃ for 35 min, then cool it in ice-water bath for 5 min. About 20 min after ice-water bath, measure the absorbance at the wavelength of 487 nm and calculate the content of polysaccharides inCordycepsmilitarisLink. [Result] The regression equation of absorbance(Y) and glucose mass(X) wasY=0.013 9X+0.007 (r=0.999 9) in the range of 10.26-102.55 μg of glucose; the average recovery was 97.7%(RSD=2.3%); the RSDs obtained in precision and repeatability experiments were 1.4% and 2.7%, respectively. The polysaccharides content inCordycepsmilitarisLink from different sources ranged from 1.21% to 4.70%. [Conclusion] The improved phenol-sulfuric acid method had higher sensitivity than before and stable color and good accuracy and repeatability, and therefore could be applied to determine polysaccharides inCordycepsmilitarisLink and provided reference for quality control ofCordycepsmilitarisLink.

CordycepsmilitarisLink; Polysaccharides; Phenol-sulfuric acid method; Content determination

“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX09301002-001)。

陰婉婷(1990- )，女，山西運城人，碩士研究生，研究方向：藥物分析。*通訊作者，主管技師，從事藥物分析研究。

2014-12-17

S 567

A

0517-6611(2015)04-117-02