帽兒山異色瓢蟲野外越冬前體內甘油·脂肪含量的變化

姜 礅，王世新，丁曉霞，孟昭軍

(東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

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帽兒山異色瓢蟲野外越冬前體內甘油·脂肪含量的變化

姜 礅，王世新，丁曉霞，孟昭軍*

(東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的]明確野外越冬異色瓢蟲[Harmoniaaxyridis(Pallas)]成蟲體內甘油、脂肪2種物質越冬前的動態變化。[方法]利用動力學方法和重量法，分別測定了其體內甘油和脂肪含量。[結果]晝長及溫、濕度共同影響異色瓢蟲越冬前體內甘油和脂肪含量的變化；在異色瓢蟲越冬前，蟲體脂肪含量達到最低值，于部分異色瓢蟲越冬期間達到最高值；而蟲體甘油含量在異色瓢蟲越冬前期及部分異色瓢蟲越冬期間達到最高值，在幾乎全部異色瓢蟲越冬期間降到最低值；甘油、脂肪含量變化與晝長及溫、濕度變化呈一定相關性，但不顯著。[結論]異色瓢蟲體內甘油與脂肪含量在越冬前呈互補變化，在部分及全部異色瓢蟲越冬期間均呈現上升和下降相似變化，其相應生化指標可作為異色瓢蟲越冬的指示。

異色瓢蟲；越冬；甘油；脂肪

異色瓢蟲屬鞘翅目瓢蟲科，是介殼蟲、蚜蟲、紅蜘蛛等害蟲的主要天敵，對其進行保護和利用是當今保護生態環境、防止農藥污染、加強綠色食品生產的重要方法之一[1]。目前其作為一種重要的生防天敵，在全世界農業生產中廣泛應用[2]。

耐寒性昆蟲通過維持蟲體的過冷卻狀態忍受凍害，過冷卻能力的維持與其體內生化物質的種類、含量變化密切相關[3]。昆蟲越冬期間體內積聚小分子量的糖或醇(如甘油、多元醇、糖等)，這些抗凍保護物質可以增加昆蟲體內束縛水的含量，或直接與酶等其他蛋白質相互作用起到保護生物系統的作用[4-5]。甘油是昆蟲體內一種重要的抗凍保護劑，可保護細胞膜和蛋白質并提高昆蟲體液的過冷卻能力[6]。低溫暴露過程中脂肪貯存對異色瓢蟲的存活是非常重要的[7]。影響昆蟲休眠與滯育的外界環境條件有光周期、溫度、水分、食物等[8]。越冬異色瓢蟲的存活率和存活時間也與保存溫度、相對濕度有密切關系[9]。目前國內主要通過對異色瓢蟲實驗種群進行人工冷馴化的方法來研究該蟲的抗寒機制，對異色瓢蟲在自然狀態下的越冬機制研究甚少。為了進一步了解異色瓢蟲的抗寒機制，筆者研究該蟲體內甘油和脂肪在野外自然狀態下越冬期間的變化動態與抗寒性的關系，以期為深入研究其發生發展規律及保護利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試瓢蟲。野外越冬異色瓢蟲成蟲采自黑龍江省尚志市帽兒山鎮老爺嶺山上的3棟向陽廢棄的小木屋中，采集時間為2013-10-07、2013-10-19、2013-11-02、2013-11-16、2013-11-30、2013-12-07、2014-05-11。試蟲采回后放于光照培養箱24 h[(25.0±1.5)℃，光暗周期為16∶8 h，相對濕度(70±5)%，選擇活動自如的個體放在-42 ℃的低溫冰箱里冷凍保存，作為甘油和脂肪含量測定的試蟲。

1.1.2供試藥劑。高碘酸鈉、無水醋酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、異丙醇、蒸餾水；氯仿、甲醇、鹽酸、無水乙醇、無水乙醚、石油醚和甘油均為分析純，均由天津市永大化學試劑有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1越冬前期異色瓢蟲體內甘油含量的測定[10]。

1.2.1.1甘油標準液配制。取1.0 g甘油放到1 000 ml容量瓶中，用蒸餾水定容，再從中取2.50 ml溶液于100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容。

1.2.1.2甘油標準曲線繪制。將21支試管平均分為3組，每組作1個重復。每組7支試管分別加入 0、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60、0.72 ml 甘油標準液(25 μl/ml)，用蒸餾水補足至1.00 ml。然后在每支試管中加入氧化劑2.00 ml(130 mg 高碘酸鈉、8 g無水醋酸銨、6.00 ml冰醋酸，待全部溶解后加蒸餾水定容至100.00 ml),搖勻，加入顯色劑2.00 ml(乙酰丙酮0.40 ml，加異丙醇溶解定容至100.00 ml)充分混合后，60 ℃水浴中加熱顯色15 min，冰水冷卻。在414 nm波長下，用紫外分光光度計測定并記錄各樣品的吸光值。以甘油含量為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.1.3試蟲甘油含量測定。分別取同一日期采集的健康異色瓢蟲3頭，蒸餾水沖洗，吸水紙吸干蟲體表面水分，置預先稱重的 EP管中稱重后，放入研缽中，加1 400 μl 蒸餾水研磨，勻漿液轉入1.50 ml EP管中。用1 600 μl蒸餾水分2次沖洗研缽，溶液轉入EP管中，5 000 r/min離心10 min，將上清液裝入10 ml帶塞玻璃試管中。沉淀加入1 000 μl蒸餾水渦旋混勻后再離心1次，合并上清液待測，用蒸餾水定容到50.00 ml。取1.00 ml待測液與標準液相同測定方法進行氧化、 顯色和比色分析。每個處理重復3次。

1.2.2越冬前期異色瓢蟲體內脂肪含量的測定。將瓢蟲置于60 ℃恒溫培養箱干燥48 h后，稱量蟲體干重。取干燥后的成蟲(3或2頭，干重質量M)于玻璃勻漿器中，加入3.00 ml氯仿和甲醇提取液(氯仿∶甲醇=2∶1,V/V)研磨成勻漿(3.00 ml提取液，先用1.40 ml研磨，再分別用0.80 ml洗滌勻漿器)，轉移至5 ml離心管中,5 000 r/min離心10 min。轉移上清，沉淀中再加入3.00 ml氯仿和甲醇提取液，再次離心，轉移上清。剩余沉淀在60 ℃恒溫培養箱中干燥24 h至恒重，稱得質量m。將上清液混合后放于蒸發皿或試管中，60 ℃水浴蒸干，取出放在干燥器中，冷卻后稱得脂肪質量x。1.2.3光周期晝長的計算及室內溫、濕度的測量。

1.2.3.1光周期晝長的計算。以黑龍江省哈爾濱市阿城區、尚志市、延壽縣三地(樣品采集地位于三地區中間)光周期晝長為重復，在百度網上查詢三地在采樣日期當天的日出、日落時間，再分別求出三地光周期晝長，以三地晝長的平均值作為樣品采集地的光周期晝長。

1.2.3.2室內溫、濕度的測量。在9月末，將溫濕度自動記錄儀放在小木屋室中央位置，溫濕度探頭懸在空中，距地面約1 m，溫濕度數據記錄頻率為1次/h，數據連續記錄到翌年5月中旬。計算采樣日期前3 d每天的溫、濕度數據平均值，將其分別作為采樣日期溫、濕度的3個重復數據，再計算其均值作為采樣當天的日平均溫度與日平均相對濕度的數據。

1.2.4數據統計。脂肪含量直接測量法：脂肪含量=x/M×100%。根據待測液的吸光值，在標準曲線上查出相應的甘油含量，按下式計算試蟲體內甘油成分的實際含量：蟲體甘油含量(μg/mg)=(從標準曲線查得的甘油含量×樣品稀釋量)/蟲重。通過Excel表格統計甘油和脂肪含量數據并做圖，利用SPSS17.0對前6次甘油和脂肪含量數據分別與溫、濕度和晝長的數據統計結果進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 野外異色瓢蟲越冬前期未滯育調查由表1可知，在2013年11月2日之前，異色瓢蟲未滯育；在11月16日，溫度逐漸接近0 ℃，晝長低于10 h之后，滯育率接近50%；而在12月21日，隨著溫度、晝長和濕度進一步降低到-8.9 ℃、8.72 h和48.7%時，異色瓢蟲幾乎全部滯育。

2.2 異色瓢蟲體內甘油含量的變化與溫度、濕度、晝長的關系由圖1可知，在2013年11月30日之前，隨著越冬場所環境溫度逐漸降低，甘油含量呈小幅波動，并在11月30日達到最高值(2.0 μl/mg)，而在12月7日甘油含量下降至最低值(0.7 μl/mg)，甘油含量變化與溫度呈低度相關(r=0.300，P=0.563)；2014年5月11日隨春天溫度的回升，甘油含量逐漸增加。

圖2和圖3表明，2013年12月7日之前，隨著越冬場所相對濕度波動降低，晝長逐漸縮短，甘油含量在12月7日下降至最低值。甘油含量變化與相對濕度呈中度相關(r=0.554，P=0.307)，與晝長也呈中度相關(r=0.509，P=0.302)。

2.3 異色瓢蟲體內脂肪含量的變化與溫度、濕度、晝長的關系由圖4～6可知，隨著環境溫、濕度及晝長的變化，蟲體平均脂肪含量在11月2日之前逐漸減少，由0.48%下降至0.38%；在11月2日至11月30日脂肪含量逐漸增加，由0.38%增加至0.47%；而在11月30日之后，脂肪含量又逐漸減少。脂肪含量變化與溫度變化無相關性(r=0.184，P=0.728)，與相對濕度變化呈低度負相關(r=-0.394，P=0.440)，與晝長變化也呈低度相關(r=0.470，P=0.347)，但2014年5月11日，隨著春天溫濕度的升高及晝長延長，脂肪含量無顯著變化。

2.4 異色瓢蟲體內脂肪含量與甘油含量的變化關系由圖7可知，在越冬前期異色瓢蟲體內甘油含量緩慢增加，而脂肪含量卻逐漸減少；在異色瓢蟲越冬期，兩者變化趨勢相似。甘油與脂肪含量變化呈低度相關，但不顯著(r=0.384，P=0.452)。

3 結論與討論

光周期和溫度為昆蟲滯育誘導、維持和終止的主要因素，光周期和溫度相互影響[11-12]。溫度對異色瓢蟲的存活影響最大，濕度次之，溫濕度的交互作用不大[9]。該研究表明，晝長、溫度和濕度共同影響異色瓢蟲越冬前體內甘油和脂肪含量的變化；蟲體脂肪含量在2013年11月2日異色瓢蟲開始進入越冬前達到最低值，于11月30日部分異色瓢蟲進入越冬期間達到最高值；而蟲體甘油含量在2013年11月2日達到越冬前的最高值，于11月30日部分異色瓢蟲進入越冬期間再次達到最高值，在12月7日幾乎全部異色瓢蟲進入越冬期間降至最低；甘油、脂肪含量變化與晝長、溫度和濕度變化呈一定相關性，但不顯著，與已有文獻不完全相符，可能與野外溫、濕度劇烈變化有關。

甘油是一種防凍劑，它的合成是越冬昆蟲對抗環境因子(特別是低溫)影響的一種固有的模式[13]。甘油的積累可以通過降低冰點和過冷卻點來提高昆蟲的抗寒能力[10]。研究發現，在越冬前期甘油含量隨晝長、環境溫度、濕度的降低而緩慢增加，后又隨著溫度的回升而減少。可能在越冬前期，隨著晝長、溫度和濕度的持續降低，甘油作為一種抗凍保護物質保護蟲體不受傷害而未被積累；溫度回升之后，異色瓢蟲體內的代謝增強需要消耗的能量也增加，部分甘油作為供能物質被消耗，是該蟲正常的生理機能反應。

低溫影響昆蟲活動和取食等行為，在低溫情況下，預先進行的脂肪儲備以及代謝中能量的節約對昆蟲的存活也是非常重要的[14]。該研究發現，在越冬開始時，受晝長、溫度和濕度降低的影響，異色瓢蟲體內脂肪含量緩慢下降，可能是由于昆蟲取食受到影響，部分游離的脂肪被該蟲消耗所造成。而隨溫度進一步降低，晝長縮短，脂肪含量緩慢增加，為抵御越冬后溫度降低而被積累。脂肪作為一種重要的抗凍保護物質增加昆蟲的抗寒性。當溫度逐漸回升時脂肪含量再次緩慢減少，是脂肪作為一種供能物質被消耗，以供應蟲體代謝增強所需能量的代謝反應。

桑螟幼蟲在越冬期體內游離脂肪一部分轉換為結合脂肪，一部分轉化為甘油和游離脂肪酸并進入血淋巴，以提高抗寒能力[15]。該研究表明，異色瓢蟲在越冬期體內脂肪和甘油也存在類似轉換，在越冬前期異色瓢蟲體內的部分脂肪轉換為甘油，造成剛越冬時脂肪含量減少，而甘油含量增加。

每年春天來臨，隨著晝長延長以及環境溫、濕度增加，多數昆蟲滯育誘導期積累糖原，而在滯育解除時轉化為糖類和醇類[16]。該研究發現在異色瓢蟲解除滯育期間，甘油含量快速增加是由于部分糖原的轉換造成的；而脂肪含量不變則是由于部分碳水化合物被消耗代替脂肪為蟲體解除滯育提供能量所致。

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[3] 韓瑞東，孫緒艮，許永玉，等.赤松毛蟲越冬幼蟲生化物質變化與抗寒性的關系[J].生態學報，2005，25(6)：1352-1356.

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[5] 王小姣.不同地理緯度蠅類耐寒耐熱性研究[D].杭州：浙江大學，2008.

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The Changes of Glycerinum and Fat Contents ofHarmoniaaxyridisbefore Natural Wintering in the Maoershan Mountain

JIANG Dun, WANG Shi-xin, DING Xiao-xia, MENG Zhao-jun*

(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] In order to illuminate the dynamical changes of glycerinum and fat contents ofHarmoniaaxyridisbefore natural wintering. [Method] Their glycerinum and fat contents were determined by dynamical and weight method. [Result] The results showed changes of glycerinum and fat contents were affected by temperature, relative humidity and daylength. The fat contents were the lowest before natural wintering ofH.axyridisand were the biggest during natural wintering of manyH.axyridis. Then glycerinum contents were the biggest before natural wintering ofH.axyridisand during natural wintering of manyH.axyridis. While glycerinum contents were the lowest during natural wintering of most ofH.axyridis. There was not significant correlation both changes of glycerinum and fat contents and temperature, relative humidity and daylength. [Conclusion] The results founded the complementary changes of glycerinum and fat contents were presented before natural wintering ofH.axyridis. The ascending and descending changes of glycerinum and fat contents were presented during natural wintering of many and most ofH.axyridis. Their biochemical criterion was regard as the symbol ofH.axyridisentering a diapause.

Harmoniaaxyridis(Pallas); Overwintering; Glycerinum; Fat

東北林業大學大學生創新創業訓練計劃項目(201310 225009)。

姜礅(1993- )，男，湖南邵陽人，本科生，專業：森林資源保護與游憩。*通訊作者，講師，博士，從事昆蟲化學生態與害蟲生物防治研究。

2014-12-18

S 433.5

A

0517-6611(2015)04-125-03