流感病毒H1N1感染A549細胞誘導凋亡及黃芩苷干預作用的研究

劉曉婷，張　沂，顧立剛，吳　珺，邱澤計，于卓男，王玥琦(北京中醫藥大學基礎醫學院.中醫藥抗病毒重點實驗室、.關鍵技術中心，北京　0009)

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流感病毒H1N1感染A549細胞誘導凋亡及黃芩苷干預作用的研究

劉曉婷1，張沂1，顧立剛1，吳珺1，邱澤計1，于卓男1，王玥琦2
(北京中醫藥大學基礎醫學院1.中醫藥抗病毒重點實驗室、2.關鍵技術中心，北京100029)

中國圖書分類號: R284.1; R329.25; R373.13; R394.2; R978. 7

摘要:目的研究黃芩苷對流感病毒H1N1感染A549細胞誘導的凋亡干預作用，探討黃芩苷抗流感病毒感染的作用機制。方法采用基因芯片技術研究流感病毒感染細胞后細胞內凋亡信號通路中相關基因轉錄的變化。同時，采用熒光定量PCR檢測各組細胞中天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白-8(caspase-8)和caspase-3的mRNA表達的變化。Western blot法檢測各組細胞中的相關蛋白的變化。結果利用基因芯片技術，通過KEGG pathway分析涉及細胞凋亡信號傳導途徑。與細胞對照組相比，H1N1感染組差異表達基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TRAIL、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調;與H1N1感染組比較，奧司他韋對照組對差異表達基因Casp3、Casp4和Casp8明顯下調;黃芩苷高劑量組對差異表達基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調;黃芩苷低劑量組除上述差異表達基因外，還明顯下調了IL1RAP 和Cn。qRT-PCR結果顯示，與細胞對照組比較，H1N1感染組caspase-3和-8的mRNA表達均明顯升高。與H1N1感染組比較，奧司他韋對照組、黃芩苷高低劑量組的caspase-3 和-8的mRNA表達均明顯降低(P＜0. 01);并且，黃芩苷低劑量組的治療效果優于高劑量組;該結果和基因芯片表達的結果基本相符。結論流感病毒體外感染細胞A549后誘導凋亡，黃芩苷能通過調控天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白家族介導凋亡通路的相關基因表達，對病毒感染誘導的細胞凋亡有干預作用，從而發揮抗病毒作用。

關鍵詞:黃芩苷;流感病毒H1N1;人肺腺癌上皮細胞A549;基因芯片;細胞凋亡;天冬半胱氨酸蛋白酶

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.010.html

顧立剛(1952－)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:中醫藥抗病毒藥理學，通訊作者，Tel: 010-64286972，E-mail: lggulg@163.com

流感病毒在宿主細胞內進行復制增殖，最終使感染細胞變性直至凋亡［1］;細胞凋亡受多種相關基

因及其蛋白調控，其中天冬半胱氨酸蛋白酶(caspase)與細胞凋亡關系最密切。黃芩苷是一種來源于植物的多羥基黃酮類化合物，具有抗病毒［2］，抗氧化［3］，抗腫瘤［4］，促進神經干細胞分化［5］，等藥理活性。有研究報道黃芩苷能緩解炎性病理損傷，通過抑制流感病毒感染引起的轉錄因子AP-1高表達而降低炎性細胞因子的分泌水平［6］;還通過影響細胞凋亡受體途徑FAS/FASL，病毒感染小鼠肺組織細胞的凋亡系統［7］，從而發揮抗流感病毒感染的作用。目前，黃芩苷對感染細胞凋亡的調控機制尚末完全闡明。因此，本研究以黃芩苷作用于流感病毒H1N1感染人肺腺癌A549細胞，探討其對細胞凋亡關鍵酶caspase-3和-8的基因表達水平的影響，明確黃芩苷體外對流感病毒誘導細胞凋亡的調控作用機制，為進一步闡明其抗流感作用機制提供更多的實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1流感病毒與實驗細胞甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株提供為中國中醫科學院中藥所為本室長期低溫保存備用。接種于9日齡雞胚尿囊腔連續傳代2次后，病毒原液血凝滴度為2－7，TCID50=10－3.778。實驗用細胞為人肺腺癌上皮細胞(A549)購自中國醫學科學院細胞中心。

1.1.2實驗藥物黃芩苷，黃色粉末，純度98. 2%，分子質量446. 35，北京中醫藥大學基礎醫學院關鍵技術中心王玥琦教授惠贈;陽性對照磷酸奧司他韋膠囊(達菲)，瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏公司生產產品，批號B1354，分裝批號SH0037。

1.1.3實驗試劑McCoy’s 5A培養基和胎牛血清(Gibco公司，美國); 0. 25%胰酶－0. 02% EDTA(Thermo公司，美國);細胞培養液(含胎牛血清體積分數0. 10和含青－鏈霉素混合物體積分數0. 01的完全McCoy’s 5A培養基)，細胞維持液(胎牛血清體積分數0. 30的McCoy’s 5A培養基); 1. 5%雞紅細胞混懸液; PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成; M-MLV反轉錄試劑盒(TaKaRa公司); qRT-PCR擴增試劑盒(北京澤平生物技術有限公司); 100 bp DNA ladder(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.2實驗分組細胞對照組(A)、H1N1感染組(B)、奧司他韋對照組(C: 0.75 mg·L－1)、黃芩苷高劑量組(F: 3. 96 mg·L－1)和黃芩苷低劑量組(G:0. 99 mg·L－1)。除正常細胞對照組外，均接種100TCID50的病毒液，每孔100 μL，置37℃，5% CO2培養箱中吸附2 h，吸棄病毒液，輕輕加入PBS清洗2次后，分別加入上述濃度的藥物。置于培養箱中培養48 h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入Tris-HCl裂解液吹打，裂解液使得細胞變圓形，浮起，收集細胞裂解液置凍存管中，置－80℃冰箱凍存。

1.2.3基因芯片分析芯片實驗由華聯生物科技股份有限公司完成。提取各組細胞的總RNA，定量并鑒定。反轉錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標記，檢定熒光強度和標記效率，芯片雜交及掃描計算探針信號在各組與模型組的強度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出與凋亡相關通路中密切相關的差異表達基因。各組探針訊號的強度比值，以log2(Ratio)表示。與H1N1感染組比較，log2(Ratio)＞1，表示明顯上調的表達基因; log2(Ratio)＜－1，表示明顯下調的表達基因。

1.2.4熒光定量PCR檢測設計GAPDH，caspase-3和caspase-8的引物序列，見Tab 1，提取各組細胞總mRNA后，進行反轉錄。按試劑盒說明，進行PCR反應。RT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動成像系統，啟動自動分析軟件，記錄目的基因擴增條帶的灰度值，并分別計算內參基因GAPDH值與各樣本目的基因的比值，統計目的基因表達的相對量，采用2－ΔΔCT方法計算。

Tab 1　Primer sequence of GAPDH，Caspase-3 and Caspase-8

1.3統計學分析采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析計量資料以±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2　結果

2.1基因芯片數據分析生物學路徑及部分經典差異表達基因通過KEGG pathway分析細胞凋亡信號傳導途徑。與細胞對照組(A)相比，H1N1感染組(B)差異表達基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TRAIL、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調;與H1N1感染組(B)比較，奧司他韋對照組(C)對差異表達基因Casp3、Casp4和Casp8明顯下調;黃芩苷高劑量組(F)對差異表達基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調;黃芩苷低劑量組(G)對差異表達基因Casp3、Casp4、Casp6、Casp8、IL1RAP和Cn明顯下調(Tab 2)。

Tab 2　Effects of A549 infected with influenza virus on apoptosis-related gene expression

2.2黃芩苷對病毒感染細胞中凋亡信號轉導通路相關mRNA表達的影響與細胞對照組(A)比較，H1N1感染組(B)Caspase-3、-8的mRNA表達均明顯升高(均P＜0. 01)。與H1N1感染組(B)比較，奧司他韋對照組(C)Caspase-3、-8的mRNA表達明顯降低(P＜0. 05或P＜0. 01);黃芩苷組(F和G)的Caspase-3、-8的mRNA表達均明顯降低(P＜0. 01);該結果和基因芯片表達的結果基本相符。見Fig 1。

3　討論

流感病毒侵犯呼吸道其主要特征引起細胞凋亡［8］。細胞凋亡又叫細胞程序性死亡，一般被分為4個階段，其中第3階段是中心控制和效應階段，凋亡信號激活ICE酶類-caspase(半胱氨酸蛋白酶家族)，caspase執行細胞有秩序的死亡。凋亡途徑分為caspase-8介導外源性途徑(死亡受體途徑)和內源性途徑(caspase-9介導依賴線粒體途徑等)［9－10］。其中caspase-3是引發細胞凋亡的關鍵因子［11］。當caspase-3被激活后，作用于Bcl-2家族某些成員如Bad，進而引起宿主胞內的結構蛋白及DNA穩定被破壞，引起細胞凋亡。

Fig 1　Comparison of expression of casp-3 and 8 in expression among groups(n =4，±s)△△P＜0.01 vs normal;＊＊P＜0.01 vs model

本實驗通過基因芯片篩選技術發現，與細胞對照組(A)相比，H1N1感染組(B)差異表達基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TNFSF10、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調;這表明，流感病毒在體外感染細胞并誘導宿主細胞凋亡是通過外源性途徑，并且主要通過高表達TRAIL誘導細胞程序性死亡［12－13］。

而黃芩苷組(F和G)對與凋亡發生密切相關的差異表達基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調。應用熒光定量RT-PCR方法，檢測相關病毒感染細胞中凋亡信號轉導通路相關mRNA的表達，結果顯示黃芩苷組(F和G)的Casp-3、-8的mRNA表達均明顯降低(P＜0. 01)。以上結果表明:黃芩苷能通過調控Casp-3、-8的表達干預流感病毒誘導的細胞凋亡。

此外，在內源性途徑中又包括caspase-9介導依賴線粒體途徑和內質網通路途徑。內質網(endoplasmic reticulum，ER)參與維持細胞內鈣離子內環境穩定、膜蛋白的合成、修飾和折疊，內質網在凋亡信號處理過程中有重要作用［14］。鈣離子穩態改變和蛋白質未折疊或錯誤折疊并在內質網蓄積可以引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，內質網應激會接激活存在于內質網上的caspase-12，存在于細胞質內的caspase-7會轉移到內質網表面，進一步活化caspase-12，活化的caspase-12剪切caspase-3，而引發細胞凋亡。近年來研究表明，人的caspase-4與小鼠的caspase-12為同源物，并且可以可特異性被ERS誘導試劑剪切激活，因而，caspase-4可能是人內質網通路途經凋亡相關蛋白［15］。此外，蛋白磷酸酶3催化亞基-α-亞型基因(Cn)也可作用于Bad，引起細胞凋亡。

實驗結果中，黃芩苷組(F和G)對與凋亡發生密切相關的差異表達基因Casp4有明顯下調;黃芩苷低劑量組(G)還引起Cn的明顯下調;這表明黃芩苷在對流感病毒誘導細胞凋亡的干預作用中，還有可能通過內質網通路途徑來調控。此外，實驗結果中沒有涉及Caspase-9的變化，因而黃芩苷可能并未通過線粒體依賴途徑發揮拮抗凋亡作用。

綜上所述，甲型流感病毒H1N1體外感染人肺腺癌細胞A549后誘導凋亡，黃芩苷能通過調控Caspase-8介導外源性途徑和內質網通路途徑的凋亡相關基因表達，從而抑制流感病毒感染誘導的細胞凋亡。細胞凋亡涉及眾多基因，網絡狀信號轉導調控模式非常復雜，因此，黃芩苷對H1N1感染的細胞凋亡的機制有待深入的實驗研究。

參考文獻:

［1］盧娜娜，劉琪，顧立剛，等.流感病毒誘導小鼠肺組織凋亡的相關基因及兩種不同中藥方藥的治療作用［J］.醫學研究生學報，2013，26(11):1134－7.

［1］Lu N N，Liu Q，Gu L G，et al.Shufengxuanfei and Jiebiaoqingli formulas on cell apoptosis in pneumonia mice infected with influenza virus［J］.J Med Postgra，2013，26(11):1134－7.

［2］高雷，陳鴻珊.黃芩苷體外對流感病毒、單純皰疹病毒和柯薩奇病毒的抑制作用［J］.中國新藥雜志，2007，17(6):474－8.

［2］Gao L，Chen H S.Inhibiting effect of baicalin on influenza，herpes simplex and CoxB3 virus infections in cultured cells［J］.Chin J New Drugs，2007，17(6):474－8.

［3］Kong F，Luan Y，Zhang Z H，et al.Baicalin protects the myocardium from reperfusion induced damage in isolated rat hearts via the antioxidant and paracrine effect［J］.Exp Ther Med，2014，7(1): 254－9.

［4］Lu H F，Hsueh S C，Ho Y T，et al.ROS mediates baicalin induced apoptosis in human promyelocytic leukemia HL-60 cells through the expression of the Gadd153 and mitochondrial-dependent pathway［J］.Anticancer Res，2007，27(1A): 117－25.

［5］張密霞，李越，杜嶸，等.黃芩苷對體外培養神經干細胞分化的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2007，12，26(4): 119－201.

［5］Zhang M X，Li Y，Du R，et al.Effect of baicalin on differentiation of neural stemcells in vitro［J］.J Tianjin Univ Tradit Chin Med，2007，12，26(4):119－201.

［6］萬巧鳳，顧立剛，殷勝駿，等.黃芩苷對FM1肺炎小鼠肺損傷的作用機制研究［J］.中國藥理學通報，2012，28(2):208－12.

［6］Wan Q F，Gu L G，Yin S J，et al.Mechanism of Baicalin on lung tissue injury of mice with FM1 induced pneumonia［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):208－12.

［7］萬巧鳳，顧立剛，殷勝駿，等.黃芩苷對FM1肺炎小鼠肺組織細胞凋亡FAS/FASL系統的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(11):1555－9.

［7］Wan Q F，Gu L G，Yin S J，et al.Effect of Baicalin on cell apoptosis FAS/FAS-L system of pneumonia mice lung tissue infected with FM1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1555－9.

［8］Pei X D，Zhai Y F，Zhang H H.Influenza virus H1N1 induced apoptosis of mouse astrocytes and the effect on protein expression ［J］.Asian Pac J Trop Med，2014，7(7):572－5.

［9］Long S，Wilson M，Bengten E，et al.Identification and characterization of a FasL-like protein and cDNAs encoding the channel catfish death-inducing signaling complex［J］.Immunogenetics，2004，56: 518－30.

［10］Nomura J，Matsumoto K，Iguchi-Ariga S M，Ariga H.Mitochondria-independent induction of Fasmediated apoptosis by MSSP ［J］.Oncol Rep，2005，14: 1305－9.

［11］Porter A G，J nicke R U.Emerging roles of caspase-3 in apoptosis［J］.Cell Death Differ，1999，6(2):99－104.

［12］Wurzer W J，Ehrhardt C，Pleschka S，et al.NF-kappaB-dependent induction of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)and Fas/FasL is crucial for efficient influenza virus propagation［J］.J Biol Chem，2004，279(30): 30931－7

［13］萬玉立.甲型流感病毒感染A549細胞的表達譜分析及相關基因功能研究［D］.北京:中國醫學科學北京協和醫學院，2009.

［13］Wan Y L.Influenza A virus infection of A549 cells expression spectrum analysis and related gene function research［D］.Beijing: Chinese Academy of medical science and Peking union medical college，2009.

［14］Du C，Fang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent Caspase activation by eliminating IAP inhibition［J］.Cell，2000，102: 33－42.

［15］Lakshmanan A P，Thandavarayan R A，Palaniyandi S S，et al.Modulation of AT-1R/CHOP-JNK-Caspase12 pathway by olmesartan treatment attenuates ER stress-induced renal apoptosis in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Eur J Pharm Sci，2011，44(5):627－34.

Effect of baicalin on apoptosis induced by H1N1 virus in vitro and its mechanism

LIU Xiao-ting1，ZHANG Yi1，GU Li-gang1，WU Jun1，QIU Ze-ji1，YU Zhuo-nan1，WANG Yue-qi2
(1.Laboratory of Chinese Medicine on Viral Disease，School of Pre-clinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Key Technological Center of Chinese Medicine，School of
Pre-clinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Abstract:Aim To investigate the regulatory effects of baicalin on apoptosis induced by virus H1N1 in human pulmonary carcinoma cell A549.Methods The chips were used to screen the RNA samples in virus-infected A549 cells.Differentially expressed genes were selected in the pathway of apoptosis.The mRNA expressions of caspase-3 and -8 were verified by Real-Time PCR.Results With the DNA microarray，the functions of differentially expressed genes involved in apoptosis biological pathways were analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway databases.caspase-3，-7，-8，-10，TRAIL，MYD88，IL1A and IL1B were up-regulated in virus-infected group.Oseltamivir could down-regulate gene expressions of caspase-3，-4 and -8.High-dose of baicalin could down-regulate gene expressions of caspase-3，-4，-6 and -8.Except gene expressions of above，low-

dose of baicalin could also down-regulate gene expressions of IL1RAP and Cn.Real-Time PCR experiments showed that baicalin could significantly decrease mRNA expression of caspase-3，-4，-6，-8，IL1RAP and Cn(P＜0. 01)，compared with the virus-infected group.The results also figured that the interference efficacy of low-dose baicalin was better than that of highdoses.As expected，real-time PCR data were in good agreement with the microarray assay.Conclusions Baicalin can be detected in their suppression effect of caspase-3，-4，-6，and -8 mRNA expression，so it resists against the apoptosis to fight against influenza virus in vitro.

Key words:baicalin; influenza(H1N1); human pulmonary carcinoma cell A549; gene chip; apoptosis; Caspase

作者簡介:劉曉婷(1983－)，女，博士生，研究方向:中醫藥抗病毒免疫學及分子生物學機制，E-mail: siccy2-0-3@163.com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81173371)

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－23

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0936－04

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.010