TGF-β1和EGFP體外電轉染兔骨髓間充質干細胞的實驗研究

文劍明，王銳英，高 燕，胡譯文，陶 波，周文靜

TGF-β1和EGFP體外電轉染兔骨髓間充質干細胞的實驗研究

文劍明1，王銳英1，高 燕2，胡譯文1，陶 波1，周文靜1

摘要目的 通過電轉染介導轉化生長因子β1（TGF-β1）轉染兔骨髓間充質干細胞（BMSCs），觀察Ⅱ型膠原表達的情況。方法 用全骨髓細胞貼壁培養法分離、培養兔BMSCs；誘導14 d后，免疫組化和Western blot法檢測Ⅱ型膠原表達。結果 BMSCs CD90表達陽性，CD31表達陰性；成功轉染TGF-β1至BMSCs；通過免疫組化及Western blot法檢測TGF-β1組細胞內Ⅱ型膠原有較強的表達，與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）組和空白對照組相比差異有統計學意義（P ＜0.05）。結論 電轉TGF-β1質粒至兔BMSCs，可以促進Ⅱ型膠原表達。

關鍵詞TGF-β1；骨髓間充質干細胞；電轉染；Ⅱ型膠原

2015-02-20接收

作者單位：1桂林醫學院附屬醫院骨二科，桂林 541000

2桂林醫學院護理學院外科護理教研室，桂林 541000

椎間盤退行性變在現實生活中是一種常見而棘手的疾病，給患者帶來巨大的痛苦，同時也讓家庭承受沉重的經濟負擔，但是目前尚無有效的方法可以根治這一病癥。椎間盤退行性變的始動因素就是髓核細胞發生退變，由于髓核細胞數量有限，發生退變后自身修復和增殖困難。目前干細胞治療退變椎間盤已經成為研究的熱點［1-2］。該實驗在電轉染介導下，將轉化生長因子β1／增強型綠色熒光蛋白（tansformating growth factor betal／enhanced green fluorescent protein，TGF-β1／EGFP）導入骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中，由于細胞內的TGF-β1基因能高效表達，并能持續分泌TGF-β1目的蛋白，誘導BMSCs向類髓核細胞方向分化，從而為修復退變的椎間盤提供種子細胞。

1　材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器 健康雄性新西蘭大白兔1只，2周齡，清潔級，約250 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。胎牛血清、DMEM低糖培養基和胰蛋白酶（美國HyClone公司）；混合質粒TGF-β1／EGFP（美國Sigma公司）；兔抗人Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體（武漢博士德公司）；流式一抗小鼠抗兔CD90（美國Abcam公司）；CD31（美國Antigenix公司）；同型對照小鼠抗兔IgG1 K（美國eBioscien公司）；流式二抗PerCP標記（美國jackson公司）；二抗免疫組織化學染色試劑盒、二抗FITC標記IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FACSAriaTMⅢ流式細胞儀（美國BD公司）；倒置相差顯微鏡、正置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2孵箱（美國Thermo公司）。

1.2 BMSCs的取出、培養及鑒定 麻醉后處死兔子，取兔兩邊的股骨、脛骨和肱骨，從兩邊干骺端剪斷，剔除肌肉，移至培養皿中，吸取培養液沖洗股骨干髓腔，取沖洗液置于培養箱中培養。利用BMSCs貼壁的特性，48 h后首次換液，以后每2 d換液1

次。細胞達80%及以上融合后，用胰蛋白酶消化傳代，重復上述培養方法進行傳代后的細胞培養。

收獲第5代BMSCs，胰酶消化，1 500 r／min離心5 min，PBS重懸細胞；分別加一抗鼠抗兔CD90、CD31，4℃避光保存30 min；PBS洗滌2次，重懸細胞，加入相應二抗山羊抗小鼠PerCP標記單克隆抗體，4℃避光放置30 min；加PBS洗滌3次，PBS重懸細胞，上機檢測。

1.3 電轉染 質粒比例配置：TGF-β1和EGFP各取10 μl。ECM830電穿儀電轉參數：電壓540 V，脈寬30 μs，脈沖數3次，脈沖間隔時間1 000 ms。電穿孔緩沖液：272 mmol／L蔗糖，7 mmol／L K2HPO4，1 mmol／L MgCl2，pH值為7.4的等滲溶液90 μl。收集第5代細胞與質粒TGF-β1／EGFP和電轉液加入到電轉杯中充分懸浮，于電轉槽中完成電轉后繼續培養，于轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察轉染TGF-β1／EGFP的BMSCs綠色熒光蛋白的表達。

1.4 免疫組化分析 取TGF-β1／EGFP轉染14 d后的細胞消化后爬片、4%多聚甲醛固定，按SP免疫組化試劑盒進行操作，DAB顯色、封片、倒置顯微鏡觀察，空質粒組及未轉染組作對照。

1.5 Western blot法測定Ⅱ型膠原蛋白的表達收集轉染14 d后的細胞，用裂解液提取蛋白；用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；上樣、煮沸10 min，離心10 s，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%SDS-PAGE）分離；常規轉膜，90 A電流轉印50 min；4℃孵育過夜；使用一抗稀釋液按比例稀釋一抗（兔抗人Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體），搖床中搖蕩1 h，以封閉液按比例稀釋二抗（辣根酶標記抗體），搖床中搖蕩1 h；加TBST后在搖床中搖蕩各洗滌3次，每次10 min；ECL發光液（A液200 μl：B液200 μl）室溫中孵育1 min，暗室中膠片曝光5 min，取同樣數量的EGFP組細胞和未轉染組細胞蛋白作為對照。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，計量資料均以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2　結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察 原代培養BMSCs 48 h換液后大量細胞貼壁生長，傳代細胞呈梭形，漩渦狀排列。見圖1。

2.2 BMSCs的鑒定 本實驗培養的兔第5代BMSCs的CD90陽性率為99.2%，CD31陽性率為0.5%，說明大多數細胞表面表達CD90分子；而CD31表達陰性，符合實驗要求。見圖2。

2.3 熒光顯微鏡觀察BMSCs轉染效果 在顯微鏡下觀察質粒的轉染效率，可見大量轉染TGF-β1／EGFP的BMSCs綠色熒光蛋白的表達，計算細胞轉染率約為70%～80%，見圖3。

2.4 Ⅱ型膠原免疫組織化學染色及光密度值 免疫組化結果顯示TGF-β1組細胞呈多邊形，胞核清晰，胞質呈棕褐色。EGFP組及空白對照組未見明顯棕褐色。見圖4。用IPP圖像分析軟件半定量測定各組Ⅱ型膠原蛋白含量［以染色平均吸光度（optical density，OD）值表示］。結果顯示TGF-β1組免疫組化平均光密度值（0.487 0±0.018 1）與EGFP組（0.085 8±0.009 7）及空白對照組（0.080 5± 0.009 8）比較，差異有統計學意義（F＝1 916.510，P ＜0.05）；EGFP組與空白對照組比較，差異無統計學意義。

2.5 Western blot法檢測Ⅱ型膠原表達 分別提取轉染14 d后及未轉染的細胞蛋白，Western blot法檢測到在相對分子質量約140 ku處有一陽性條帶，見圖5。SensiAnsys凝膠圖像分析系統分析結果顯示，TGF-β1組Ⅱ型膠原表達（0.450 0±0.106 7）與EGFP組（0.201 2±0.007 4）及空白對照組（0.196 4±0.004 1）比較差異有統計學意義（F＝33.089，P ＜0.05）；EGFP組與空白對照組比較差異無統計學意義。

3　討論

椎間盤退變的修復是臨床常見的難題之一，近年來隨著軟骨組織工程的發展為修復退變的椎間盤帶來了希望，在軟骨組織工程中利用外源基因轉染種子細胞并使其高效表達，誘導靶細胞向軟骨細胞分化。目前，主要的轉染方法有脂質體轉染、病毒轉染和物理轉染方法等。脂質體轉染效率低，病毒轉染效率高，對細胞毒性也高。物理轉染方法在組織工程的TGF-β1基因轉染應用中少見相關報道［3］。理想的種子細胞應具有取材方便，對機體損傷小，在體外容易培養擴增等優點。組織工程中常用的有BMSCs、脂肪間干細胞、關節軟骨細胞等，其中BMSCs應用最廣泛。

BMSCs是一類存在于髓腔內、具有自我更新、增殖和多向分化潛能的非造血干細胞，是目前應用較廣泛的骨組織工程的重要種子細胞之一［4］。原代培養的BMSCs雜質較多，形態不一，接種2 d后可見較多的梭形細胞排列生長，隨后細胞長滿時，呈漩渦狀生長。細胞表面標記CD90表達陽性，CD31表達陰性可初步判斷為兔BMSCs［5-6］。

Ⅱ型膠原是軟骨組織中重要的細胞外基質成分，在軟骨中占大部分比例，是髓核細胞的特異性標志物之一［7］。本實驗BMSCs經成軟骨誘導后，細胞質內的Ⅱ型膠原蛋白含量較未誘導組明顯提高。結果證明經誘導后BMSCs成功向類髓核細胞分化。

適當濃度的TGF-β1能刺激軟骨細胞增殖、分裂和分化，故目前是軟骨組織工程研究中首選生長因子［8］，大量研究［9］結果表明，在低氧環境及TGF-β1存在的條件下，具有能誘導BMSCs向類髓核細胞方向分化的作用，具有取材方便、便于保存、操作簡單的優點。TGF-β家族的傳導通路主要是Smad蛋白［10］，可增強膠原、細胞黏附蛋白的表達。Smad-3為Smad基因家族成員，其基因產物是TGF-β信號通道中的細胞質成分，具有MH1、MH2和L區3個功能域［11］，TGF-β1激活的Smad-3能抑制基質降解酶，誘導膠原蛋白表達，促進軟骨基質的合成［12］。

單純應用生長因子誘導細胞，需要不斷添加生長因子，存在持續時間短、效率低、成本高的缺點；轉基因技術可將多種軟骨生長因子導入細胞，具有廣闊應用前景［13］。電轉染的原理是通過高強度電場的作用，瞬時增加細胞膜的通透性，從而使細胞周圍外源分子進入細胞內部；具有較高的轉染效率，適用范圍廣，轉染后細胞可繼續培養不影響細胞增殖速度；此外，不需要構建基因載體，對細胞無毒性。有研究［14］表明電轉染不影響細胞的生物學特性。

本實驗利用電轉染介導TGF-β1和EGFP體外轉染BMSCs，其中EGFP作為報告基因，因此只要出現熒光就說明TGF-β1在細胞內。經TGF-β1轉染后，免疫組化示BMSCs胞質呈陽性表達，Western blot檢測結果示Ⅱ型膠原能高效表達。因此根據實驗結果可認為，電轉染介導TGF-β1和EGFP基因轉染BMSCs可使TGF-β1目的基因在細胞內能持續高

效表達，進而誘導BMSCs向類髓核細胞方向分化。

通過本次實驗結果可知，利用電轉染可將TGF-β1和EGFP基因高效導入BMSCs中，成功誘導為類髓核細胞，表達Ⅱ型膠原，有望成為軟骨組織工程中理想的種子細胞，從而為椎間盤退行性變化的治療奠定基礎。至于TGF-β1轉染BMSCs植入體內后，目的基因是否還能持續高效的表達，并誘導成類髓核細胞、修復退變的椎間盤等問題尚需進一步研究。

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TGF-β1 and EGFP electropration on rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro

Wen Jianming1，Wang Ruiying1，Gao Yan2，et al
（1Dept of Orthopedics，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000；2Dept of Surgical Nursing，Nursed Faculty of Guilin Medical University，Guilin 541000）

AbstractObjective To observe cases of typeⅡcollagen expression after transforming growth factor-β1（TGF-β1）infected in rabbit bone mesenchymal stem cells（BMSCs）by electropration.Methods BMSCs from rabbit were isolated and cultured.14 days after induction，immunohistochemistry and Western blot methods typeⅡcollagen were used to detect the expression of typeⅡcollagen.Results CD90 was positive and CD31 was negative by flow cytometry；successfully transfected with TGF-β1 to the BMSCs，the strong expression of typeⅡcollagen in TGF-β1 group cells was shown by Western blot and immunocy-tochemical stain，which was compared with empty plasmid group and the control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion TGF-β1 plasmid by electroporation to rabbit BMSCs can facilitate expression of collagenⅡ.

Key wordstransforming growth factor beta 1；mesenchymal stem cells；electropration；collagenⅡ

作者簡介：文劍明，男，碩士研究生；王銳英，男，博士，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：rywang＠glmc.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260233）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0581-04

中圖分類號R 682.3