高效液相色譜法測血清中25-羥維生素D3

劉怡欣，賽 娜，趙世晶，李紫薇，黃國偉（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津 300070）

論著

高效液相色譜法測血清中25-羥維生素D3

劉怡欣，賽 娜，趙世晶，李紫薇，黃國偉
（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津 300070）

目的：建立檢測血清中25-羥維生素D3[25（OH）D3]的高效液相色譜分析方法。方法：樣品用甲醇沉淀蛋白，以正己烷提取后，離心取上清液過膜。甲醇-水（95∶5）為流動(dòng)相，選用Venusil MP-C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長265 nm，柱溫30℃。結(jié)果：25（OH）D3在線性范圍4.00～160.00 μg/L內(nèi)與其響應(yīng)值線性關(guān)系良好（r= 0.999 9），4.00、8.00、16.00、80.00 μg/L的25（OH）D3的平均回收率分別為85.22%、92.50%、100.75%、109.50%，RSD分別為4.32%、2.91%、2.25%、1.78%（n=4），測健康成年人血清25（OH）D3濃度為（38.14±14.74）μg/L。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，可用于血清中25（OH）D3的檢測。

高效液相色譜法；25-羥維生素D3；血清

維生素D是一種脂溶性維生素，也是一種類固醇衍生物，主要來源于食物及皮膚合成。近年來研究顯示，維生素D不僅能夠調(diào)節(jié)鈣磷平衡和骨骼代謝，還具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、調(diào)控細(xì)胞增殖、防治代謝綜合征、抗炎、保護(hù)心血管健康等多種生物學(xué)功能[1]。臨床和流行病學(xué)證據(jù)也表明，維生素D對(duì)胰島具有保護(hù)作用，并且是維持正常的胰島素分泌和糖耐量所必需的物質(zhì)[2]。維生素D缺乏的狀況在全球范圍內(nèi)普遍存在。按照國際上對(duì)維生素D狀態(tài)評(píng)價(jià)的普遍標(biāo)準(zhǔn)[3]，全球已有50%的人口存在維生素D缺乏的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，有必要探索建立一種可靠、高效的測定方法，為維生素D的檢測、相關(guān)疾病的研究與診斷提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。目前臨床上普遍接受維生素D的評(píng)價(jià)指標(biāo)是25-羥維生素D3[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D3]，因?yàn)樗纳锇胨テ谑?周左右，較1，25-二羥維生素D3[1，25-dihydroxyvitamin D，1，25（OH）2D3]（半衰期4～6 h）更為穩(wěn)定[5]。常用的測血液中25（OH）D3的方法有競爭蛋白結(jié)合法（CPBA）、放射免疫法（RIA）、ELISA、高效液相色譜法（HPLC）[6]等，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，采用HPLC法建立血清25（OH）D3的檢測方法，并應(yīng)用于健康成年人的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 600E高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BSA224S電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，d=0.1 mg）；Venusil MP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；QL-901漩渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；2-16PK型離心機(jī)（美國Sigma公司）；超純水系統(tǒng)（Mili-Q integral 10,美國密理博公司）。

25（OH）D3對(duì)照品（美國Sigma公司，705888-1 MG），純度＞98%（HPLC級(jí)）；人血清（天津市和平區(qū)健康教育指導(dǎo)中心）；甲醇、正己烷（天津博納艾杰爾科技有限公司，色譜純）；高純氮?dú)猓ㄌ旖蛸惷讱怏w有限公司）。

1.2 研究對(duì)象的一般情況 收集2014年天津市和平區(qū)健康教育指導(dǎo)中心的健康體檢者血清樣本30例，男、女比例為1∶1，平均年齡（50.95±10.94）歲。所有研究對(duì)象均未患糖尿病、肥胖、甲狀腺功能不全、腫瘤等疾病，近期無外傷、感染，且連續(xù)3個(gè)月沒有服用維生素D及其衍生物和鈣劑。研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Venusil MP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（95∶5）溶液；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取25（OH）D3對(duì)照品5 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為500 μg/mL對(duì)照品溶液，使用時(shí)用甲醇稀釋。

1.3.3 血清樣品處理 精密量取0.5 mL血清置于15 mL離心管中，加入0.8 mL甲醇，漩渦震蕩2 min，加入4 mL正己烷，漩渦震蕩2 min，5 000 r/min 4℃離心5 min，精密吸取上層清液于室溫（25℃）氮?dú)獯蹈桑蹈珊髿堅(jiān)⒓从?50 μL甲醇溶液復(fù)溶。

1.3.4 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確量取按照“1.3.3”項(xiàng)下處理的血清樣本溶液150μL，用0.22μm的微孔濾膜過濾后，將液體注入樣品瓶中，即得供試品溶液。1.3.5 陰性對(duì)照溶液的制備 準(zhǔn)確量取0.5 mL空白血清，按照“1.3.3”及“1.3.4”項(xiàng)下的步驟，制備成空白對(duì)照溶液。

1.3.6 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。

1.3.7 線性關(guān)系考察 精密量取10 μL 500 μg/mL的對(duì)照品溶液，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋，制備成4.00、8.00、16.00、80.00、160.00 μg/L濃度梯度的系列對(duì)照溶液。分別按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行測定。

1.3.8 精密度試驗(yàn) （1）日內(nèi)精密度：取25（OH）D3對(duì)照品溶液適量，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次，進(jìn)樣量20 μL，記錄峰面積；（2）日間精密度：取25（OH）D3對(duì)照品溶液適量，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、1、2、3、4 d進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) （1）室溫穩(wěn)定性：取同一供試品溶液適量于室溫下（25℃）避光放置，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于制備后0、2、4、6 h進(jìn)樣20 μL測定，記錄峰面積；（2）冷藏穩(wěn)定性：取同一供試品溶液適量置于4℃條件下，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于制備后0、1、2 d進(jìn)樣測定，記錄峰面積；（3）冷凍穩(wěn)定性：取同一供試品溶液適量置于冰凍條件下（-20℃），按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于制備后0、3、6、9 d進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.3.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一血清樣品適量，共3份，分別按照“1.3.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件各取20 μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.3.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取同一血清樣品適量，共4份，分別加入濃度為4.00、8.00、16.00、80.00 μg/L的25（OH）D3對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件各取20 μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算方法的加樣回收率。

1.3.12 樣品含量測定 取30例健康成年人的血清樣本，分別按照“1.3.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件各取20 μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算25（OH）D3的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果 按照HPLC測定方法及相應(yīng)濃度，繪制色譜圖，見圖1。由圖可知該液相條件下，25（OH）D3的保留時(shí)間為12.55 min，出峰時(shí)間適宜，峰形良好，且能與其他峰有效地分離。

圖1 25（OH）D3對(duì)照品（a）、供試品（b）和陰性對(duì)照品溶液（c）的HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果 以25（OH）D3濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作線性回歸，得線性方程為：Y=1 900.7X+67.086（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明25（OH）D3在4.00～160.00 μg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積分值線性關(guān)系良好，最低定量限（LOQ）為4.00 μg/L。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 血清25（OH）D3的日內(nèi)精密度RSD為2.00%～4.62%，日間精密度RSD為2.68%～5.15%，表明該方法的重現(xiàn)性良好，符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 （1）血清25(OH)D3室溫穩(wěn)定性RSD為3.60%，表明血清樣品在室溫下6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；（2）血清25（OH）D3冷藏定性RSD為3.10%，表明血清樣品在4℃下3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好；（3）血清25（OH）D3冷凍穩(wěn)定性RSD為2.92%，表明血清樣品在-20℃下9 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 25（OH）D3的血清樣品溶液重復(fù)性RSD=0.93%（n=3），表明本方法重復(fù)性良好。2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 測定結(jié)果見表1。

表1 25（OH）D3的平均加樣回收率（n=4）

2.7 樣品含量測定結(jié)果 30例健康成年人血清25 （OH）D3平均濃度為（38.14±14.74）μg/L，RSD小于4%。

3 討論

3.1 測定方法的評(píng)價(jià) CPBA、RIA法使用放射性核素、分析費(fèi)時(shí)、不同試劑盒間存在差異，且抗體之間的交叉反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致免疫分析方法的特異性不足，而HPLC法不存在上述缺點(diǎn)，HPLC儀器復(fù)雜，但分析操作省時(shí)、省力，具有分離效能高、分析速度快、重復(fù)性好、節(jié)約成本、精確度高、可自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[9]。3.2 色譜條件的選擇 （1）測定波長的選擇：對(duì)25 （OH）D3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長掃描，結(jié)果表明其最大吸收在波長265 nm處，故選擇在此波長下進(jìn)行25 （OH）D3的測定，避免了血清內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，提高了靈敏度。（2）色譜條件的確定：有文獻(xiàn)采用乙腈作為流動(dòng)相[10]，考慮到乙腈毒性較大、價(jià)格昂貴，故改用甲醇-水為流動(dòng)相。經(jīng)多次試驗(yàn)，最終將流動(dòng)相比例調(diào)為甲醇-水（95∶5），流速為1.0 mL/min，在此條件下，25（OH）D3出峰時(shí)間適宜，峰形良好，待測物能與其他雜質(zhì)較好地分離。（3）樣品提取溶劑的選擇：曾分別用氯仿、正己烷提取血清中25（OH）D3，氯仿作為提取劑時(shí)，氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間較正己烷長，根據(jù)提取效果，最后確定用正己烷進(jìn)行液-液萃取，血中雜質(zhì)不影響被測組分的檢出，同時(shí)獲得了較高且穩(wěn)定的提取回收率。

3.3 檢測方法的應(yīng)用 本研究的臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，健康成年人的血清25（OH）D3的均值為（38.14± 14.74）μg/L。這與相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，表明本試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性良好。

綜上所述，本試驗(yàn)建立并驗(yàn)證了血清中25 （OH）D3的高效液相色譜測定方法，總體來說回收率高，精密度、準(zhǔn)確性較好，可應(yīng)用于未來血清25 （OH）D3的檢測。

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（2014－11－14收稿）

R15

A

1006-8147（2015）04-0348-03

劉怡欣（1988-），女，碩士在讀，研究方向：營養(yǎng)與慢性病防治；通信作者：黃國偉，E-mail:huangguowei@tijmu.edu.cn。