結核T細胞斑點試驗在結核性胸膜炎中的價值

莊 妍，賴雁平

（天津醫科大學第二醫院呼吸內科，天津 300211）

結核病大多表現為肺結核，但仍有15%～25%的患者為淋巴結結核或結核性胸膜炎[1]。該病臨床癥狀多不典型，確診需在胸腔積液或胸膜組織中找到結核菌，但結核菌培養的陽性率低，培養周期長。應用胸膜活檢也可以確診，但具有創傷性，使其應用受限。目前外周血結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT.TB）對于結核病的輔助診斷價值得到國內外的一致認同，但胸腔積液T-SPOT.TB對結核性胸膜炎的診斷價值仍存在爭議。90%結核性胸膜炎表現為以淋巴細胞為主的滲出性胸腔積液，因此在臨床工作中，此檢驗結果多提示高度可疑結核性胸膜炎。本研究旨在探討T-SPOT.TB對鑒別診斷結核性胸膜炎和其他淋巴細胞為主的滲出性胸腔積液的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年1月-2014年4月我院呼吸科收治的單側胸腔積液患者63例，其均符合淋巴細胞為主的滲出性胸腔積液。滲出液的診斷標準參考Light’s標準[2]，即以下3項標準中符合任何一項即可確診為滲出液，均不符合則為漏出液：（1）胸液/血清蛋白（P/SPro）＞0.5；（2）胸液/血清乳酸脫氫酶（P/SLDH）＞0.6；（3）胸液乳酸脫氫酶（PE LDH）大于正常血清乳酸脫氫酶上限的2/3。淋巴細胞為主的診斷標準為胸腔積液細胞分類計數中淋巴細胞占有核細胞的比例>50%。全部病例中結核性胸膜炎患者32例，其中經病原學確診（胸腔積液或胸膜活檢組織培養出結核分枝桿菌）13例，經組織學確診（胸膜活檢病理示干酪樣肉芽腫）6例，臨床診斷[3]13例，且經抗結核治療有效。非結核性胸膜炎患者31例，均已排除結核性胸膜炎，且明確診斷其他疾病，經治療原發病有效。其中惡性胸腔積液19例（肺癌16例、乳腺癌1例、卵巢癌1例、淋巴瘤1例），肺炎旁胸腔積液9例，系統性紅斑狼瘡1例，類風濕性關節炎1例，肝硬化1例。入選者均簽署知情同意書，且排除：<16歲，孕婦，HIV陽性，近1周內應用利尿劑，因肝病或嚴重營養不良所致低蛋白血癥。

1.2 方法 采集所有患者（治療前）外周靜脈血5 mL和新鮮胸腔積液50mL，應用肝素抗凝管，室溫保存，標本采集后2 h內送檢，4 h內完成檢測。應用T-SPOT.TB試劑盒（英國，Oxford Immunotec公司），標本經分離得到外周血單核細胞（PBMCs）和胸液單核細胞（PEMCs），制備成細胞懸液。在包被γ-干擾素抗體的微孔板上，加入細胞培養液作為陰性對照，植物血凝素作為陽性對照，結核分枝桿菌特異性抗原—早期分泌靶向抗原6 kD和培養濾過蛋白10 kD作為刺激抗原。每孔加入細胞懸液，放在培養箱中培養18～20 h，洗板后加入生物素標記的二抗，4℃反應1 h，洗板后加入顯色底物液，靜置7min，去離子水終止反應。通過T淋巴細胞酶聯免疫斑點系統記錄斑點形成細胞數。結果判定：若陰性對照孔的斑點數<10，且陽性對照孔的斑點數>20，試驗有效。若空白對照孔斑點數<6，且任一試驗孔斑點數－空白對照孔斑點數≥6，結果為陽性；當空白對照孔斑點數>6，且任一試驗孔斑點數≥2×空白對照孔斑點數時，結果亦為陽性。

1.3 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件處理數據。敏感性=陽性例數/總例數，特異性=1－敏感性。所有數據均首先進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料用x±s表示，采用t檢驗進行組間比較；非正態分布的計量資料用中位數 [四分位間距]表示，采用非參數秩和檢驗進行組間比較。兩組間一般情況中的分類變量及反應率比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線對診斷價值進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者基本情況及檢驗指標 表1列出了受試者的年齡、性別、近1月有無應用激素或免疫抑制劑、有無結核病史或影像學陳舊性肺結核改變、有無糖尿病、高血壓等基礎疾病及外周血和胸腔積液中的一些檢驗指標，其中結核性胸膜炎組胸液中的中性粒細胞比例較非結核性胸膜炎組高（P<0.05）。

表1 受試者基本情況及檢驗指標Tab1 Generalcausesand physicalexam inationsof sub jects

2.2 T-SPOT.TB測定 32例結核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB檢測結果為29例陽性，3例陰性，胸腔積液檢測結果為30例陽性，2例陰性。31例非結核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB檢測結果為10例陽性，21例陰性，胸腔積液檢測結果為3例陽性，28例陰性。胸腔積液檢測的敏感性高于外周血，但無統計學意義（P>0.05）；其特異性明顯高于外周血（P<0.05）。胸腔積液釋放γ-干擾素的特異性T細胞數顯著高于外周血（P<0.05）。見表2。

表2 外周血與胸腔積液的T-SPOT.TB檢測結果Tab2 The data of serum and pleural T-SPOT.TB

2.3 繪制ROC曲線 在63例胸腔積液患者中，以病原學/組織學或臨床診斷作為確定結核性胸膜炎的標準，以釋放γ-干擾素的特異性T細胞數為標準繪制ROC曲線，見圖1。外周血的ROC曲線下面積為0.880，當取值分別為21和75 SFCs/106PBMC時，敏感性分別為81.3%和65.6%，特異性為77.4%和96.8%。胸腔積液的ROC曲線下面積為0.964，當取值分別為12和133SFCs/106PEMC時，敏感性分別為93.8%和81.3%，特異性為90.3%和96.8%。

圖1 外周血及胸腔積液T-SPOT.TB的ROC曲線Fig 1 ROC curveof serum and pleural T-SPOT.TB

3 討論

結核桿菌感染產生以細胞介導為主的免疫反應，T淋巴細胞在初次感染致敏后成為記憶T細胞在體內長期存在，當再次接觸結核桿菌時活化增殖為效應T細胞，釋放多種細胞因子，其中由輔助T淋巴細胞（CD4+、CD8+）產生的 γ-干擾素是最為關鍵的細胞因子[4-5]。T-SPOT.TB以早期分泌靶向抗原6 kD和培養濾過蛋白10 kD為特異性抗原，刺激從外周血或體液分離的單核細胞產生γ-干擾素，再通過酶聯免疫斑點技術計數特異性T細胞數目。這些特異性抗原由RD1基因區所編碼，該區域僅存在于結核分枝桿菌和少數致病性分枝桿菌的基因組中，不存在于非致病性分枝桿菌屬和卡介苗疫苗株中，且兩種抗原聯合檢測針對不同表位進行反應，從理論上保證了T-SPOT.TB的高敏感性和特異性。但在結核病流行地區，外周血T-SPOT.TB的特異性較低，為67.0%～90.5%[6-7]，這是由于結核疫區存在較多的潛伏感染患者所致。理論上活動性結核感染的T-SPOT.TB的斑點數應較潛伏性感染更多，但事實并非如此，其可能的原因為：當潛伏性結核感染者的免疫功能良好時，少量抗原刺激就能激發出活躍的免疫反應；或者當活動性結核患者免疫功能低下時，大量抗原刺激也不足以激起有效的免疫反應。在此種背景下，選擇特異性較高的臨界值，比根據ROC曲線確定的最佳臨界值更有意義[8]。作為臨床醫生，需要在不同的臨床背景下選擇對于實際工作最理想的臨界值。正如本研究所示，在外周血及胸液臨界值分別取值75 SFCs/106PBMC和133 SFCs/106PEMC時，其特異性較高。在肺外結核病中，結核抗原特異性效應T細胞迅速增殖，并被募集到感染部位，病變局部呈免疫病理學的隔室化反應[9]，故外周血中的效應T細胞減少，感染部位的效應T細胞增多，因此理論上認為對感染部位進行T-SPOT.TB檢測有可能獲得更高的敏感性和特異性。目前有學者認為T-SPOT.TB的檢測范圍已不僅局限于外周血，還可應用于痰液、胸水、腹水及腦脊液等[10-11]。但對于胸腔積液T-SPOT.TB的研究結果仍存在爭議，有些學者認為其對結核性胸膜炎的診斷價值高于外周血[12-13]，有些則認為其不確定因素較多，結果不盡人意[8]。而我們的研究認為胸液T-SPOT.TB的敏感性、特異性均高于外周血。

結核性胸膜炎是結核分枝桿菌及代謝產物直接侵及胸膜腔引起的胸膜炎癥，多表現為淋巴細胞為主的滲出性胸腔積液。在臨床工作中，肺炎旁胸腔積液、膿胸的患者通常表現為高熱、嚴重感染癥狀、血象升高，胸腔積液為膿性或中性粒細胞為主，與結核性胸膜炎鑒別診斷較容易。但仍有17%的結核性胸膜炎的胸腔積液中淋巴細胞比例<50%，本研究只討論了淋巴細胞為主的滲出性胸腔積液中TSPOT.TB的診斷價值，而以中性粒細胞為主的滲出液未在研究范圍之內。此外，本研究通過Light’s標準判定滲出性胸腔積液，但應用利尿劑可以將一部分漏出液錯誤地判斷為滲出液，且低蛋白血癥亦可能影響滲出液的判定，因此本研究將近1周內應用利尿劑及各種原因所致的低蛋白血癥患者作為排除標準。目前國內對于T-SPOT.TB的研究樣本量均偏小，本研究同樣存在此問題，尚需在今后的研究中擴大樣本量；另外，最終診斷為結核性胸膜炎的個別病例通過臨床確診，可能會影響結果的嚴謹性，但若將臨床確診病例全部排除，只研究微生物或病理確診病例，可能仍不可避免地造成結論存在一定偏差。

最終，我們的研究得到以下兩個主要結論：一是胸液T-SPOT.TB是較好的診斷結核性胸膜炎的指標;二是當胸液T-SPOT.TB斑點數≥133 SFCs/106PEMC時具有較高的診斷特異性。

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