子宮結合帶干細胞的培養與鑒定

康康，王藹明，尹善德，趙勇，王明凱，黃紹敏

間充質干細胞(m esenchym al stem cells，MSCs)屬于成體干細胞，是一種具有自我更新和多向分化能力的多能細胞[1]，子宮內膜干細胞在2004年被發現并分離出來，目前已應用于多種臨床試驗及動物實驗[2-4]。雖然子宮內膜再生能力強，其應用價值已得到一定程度的肯定，但畢竟數量有限，而子宮結合帶組織標本充足，與子宮內膜具有相似性[5]和相同的胚胎起源[6-7]，其厚度變化與子宮內膜一樣具有周期性，且探索子宮結合帶組織中是否含有MSCs具有重要意義。近年來，有學者提出子宮內膜異位癥(EH)的干細胞學說，認為EH病灶中的終末細胞不能維持病灶的長期發展[8-10]，且已有研究發現EH患者子宮結合帶的厚度發生改變，甚至有學者提出可通過結合帶的厚度改變來診斷EH[11]。若子宮結合帶中含有MSCs，即子宮結合帶干細胞(uterine junctional zone stem cells，uJZSCs)，其是否參與了EH的發生發展仍有待探究。本研究觀察子宮結合帶細胞形態，貼壁情況，表面標志物表達情況，細胞生長動力學特征以及成脂、成骨誘導分化能力，旨在綜合評估子宮結合帶是否可作為MSCs的來源。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理 子宮結合帶組織由海軍總醫院手術室提供，均取自育齡期女性，年齡30～52歲，因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌而行子宮切除術(術前3個月內未服用激素類藥物)。所取組織均遠離患處2cm以上，首先去除子宮內膜組織，用無菌生理鹽水反復沖洗后，獲取子宮結合帶組織(均由病理學證實[12])，置入無菌生理鹽水中，2h內送實驗室培養。所有子宮結合帶組織均經病理檢查排除子宮內膜，標本留取經本院倫理委員會批準，征得患者同意并簽署知情同意書。

樣本的處理及培養：樣本送至實驗室后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復洗滌，直至去除紅細胞，將標本剪成10mm3小塊，加入2倍體積0.25%胰酶，置于37℃水浴箱中消化30m in，加入等體積含10% FBS的IMDM培養基中止消化。以2500r/m in離心10m in，并用PBS洗滌2次，加入2倍體積0.1%膠原酶Ⅰ消化2h，2000r/m in離心8m in，用PBS清洗2次后接種到培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，72h后半量更換培養基，之后每周更換2次。

1.2 試劑與儀器 IMDM培養基及試劑購于Gib co公司，胎牛血清(FBS)購于四季清公司，CCK-8試劑盒購于Do jindo公司，CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC購于BD公司。流式細胞儀(型號為BD FACS Calibu r)購于BD公司。

1.3 u JZSCs形態學觀察 細胞接種后72h半量換液，7d后全量換液，去除未貼壁細胞，待細胞融合程度達80%～90%時，用0.125%胰酶消化后傳代，并于每一代傳代前用倒置顯微鏡拍照記錄。

1.4 u JZSCs細胞表面標志物分析 取第3代對數生長期細胞進行免疫表型分析，鑒定所培養的細胞為MSCs，用0.1%胰酶消化并采集細胞，制成1×106/m l的單細胞懸液，分別向預先加入抗體CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD 34-PE、CD 45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLAABC-FITC的Falcon管各加100μl細胞懸液，以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP為陰性對照。避光孵育20m in，PBS洗滌2次，重懸后進行流式細胞儀檢測。采用CellQuest Pro對數據進行分析。

1.5 u JZSCs細胞存活率測定 取第3代對數生長期細胞，0.1%胰酶消化，采集細胞，制成1×106/m l單細胞懸液，重懸，加7-AAD染色，渦旋震蕩均勻，避光15m in，PBS洗滌2次后，4℃避光保存，立即用流式細胞儀(型號為BD FACS Calibu r)進行檢測。采用CellQuest Pro對數據進行分析。

1.6 u JZSCs細胞周期測定 取第3代對數生長期細胞，0.1%胰酶消化后采集細胞，制成1×106/m l的單細胞懸液，向Falcon管中加入－20℃預冷的75%乙醇2m l，再迅速加入100μl細胞懸液，渦旋震蕩均勻，－20℃放置3h。將固定好的細胞1500r/m in離心5m in，棄上清；渦旋震蕩均勻，加入RNaseA(20m g/m l)10μl，37℃水浴30m in；水浴后將樣品置于4℃冰箱10m in終止酶反應；加入5μl的碘化丙啶(PI)溶液，4℃避光孵育30m in；渦旋震蕩均勻，離心，4℃避光保存，3h內用流式細胞儀進行檢測。采用CellQuest Pro對數據進行分析。

1.7 u JZSCs生長曲線測定 將第3代對數生長期細胞以1×103個/孔的密度接種于96孔板，設置4個復孔，同時設置調零孔，分別于第1～8天同一時間加入10μl CCK-8，孵育2h后用酶標儀進行檢測，在450nm條件下檢測吸光度(A)值，并繪制生長曲線。

1.8 u JZSCs誘導分化能力鑒定 成脂分化：將P5代細胞按照2.1×106/cm2密度接種，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，待細胞完全融合后更換成脂分化完全培養基A，72h后更換成脂分化誘導完全培養基B，如此循環3～5次后，用成脂分化誘導完全培養基B繼續維持7d，每3d換液1次；分化誘導完成后固定，油紅O染色，光鏡下觀察并拍照。

成骨分化：將P5代細胞按照3.1×103/cm2密度接種，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，直至間質干細胞達到50%～70%融合，然后更換成成骨誘導分化培養基，每3d換液1次；分化誘導完成后固定，茜素紅染色，光鏡下觀察并拍照。

成軟骨誘導分化：將P5代細胞按照5×105/m l密度加入成軟骨分化培養基重懸細胞，吸取10μl滴到6孔板上，放置24h后加入新鮮的誘導分化培養基，21d后用阿利信藍染色，光鏡下觀察并拍照。1.9 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 u JZSCs的形態學特點 原代細胞接種后第3天半量換液，可見少量貼壁細胞；于第7天全量換液，此后細胞迅速貼壁，細胞集落明顯增大、增多，接種后第10～14天細胞達80%～90%融合。傳代后細胞3～6h貼壁，細胞融合并呈長梭形，漩渦狀生長，3～4d后細胞傳代(圖1)。

2.2 u JZSCs細胞表面標志物分析 流式細胞儀檢測結果顯示，第3代u JZSCs表面標志物CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD13、CD166、HLA-ABC的表達呈陽性，而造血干細胞表面標志物CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達(圖2)。

2.3 u JZSCs細胞存活率分析 流式細胞儀檢測結果顯示，u JZSCs細胞存活率(94.32%±0.96%)較高，細胞生長狀態好，適應環境能力強(圖3)。

圖1 u JZSCs的P0(A、B)和P3(C、D)代細胞(×100)Fig.1 u JZSCs at passage 0 (A and B) and passage 3 (C and D) (×100)

圖2 u JZSCs表面標志物表達Fig.2 Exp ression of cell su rfactan ts in cu ltu red u JZSCs (Flow cytom etry)

圖3 u JZSCs細胞活率檢測結果Fig.3 Cell viab ility of cu ltu red EnMSCs (Flow cytom etry)A. Ce ll d istribu tion; B. Histog ram of ce ll viab ility; C. Scatterp lo t of ce ll viab ility

2.4 u JZSCs細胞周期分析 采用流式細胞術測定各周期細胞的百分比，結果顯示處于DNA合成期的細胞比例較高(G2+S期為30.3%)，u JZSCs的增殖能力相對較強(圖4)。

2.5 u JZSCs細胞的生長曲線 細胞傳代后，增殖曲線呈S型，1～3d生長速度較慢，屬于潛伏期，4～6d進入對數生長期，于7～9d進入平臺期，此時細胞已達到90%～95%融合(圖5)。

圖4 u JZSCs細胞周期檢測結果Fig.4 Cell cycle analysis of u JZSCs (Flow cytom etry)

圖5 u JZSCs細胞生長曲線Fig.5 The grow th curve of u JZSCs in p resent experim ent

2.6 u JZSCs成脂、成骨、成軟骨誘導分化結果成脂分化：u JZSCs經成脂誘導分化21d后，油紅O染色倒置顯微鏡下觀察可見細胞質中充滿紅色的油滴(圖6A)。成骨分化：u JZSCs經成骨誘導分化21d后，采用茜素紅進行鈣化結節染色，可見致密生長的細胞中散在出現大小不一的橘紅色礦化結節(圖6B)。成軟骨分化：u JZSCs經成軟骨誘導分化21d后，采用阿利辛藍對細胞團進行染色，可見大小不一的藍色結節(圖6C)。

3 討 論

圖6 光鏡下觀察u JZSCs的誘導分化(×100)Fig.6 Induced d ifferen tiations of u JZSCs (×100)A. Ad ipogenic (Oil red O); B. Osteogenic (Alizarin red); C. Chond rogen ic (Alcian b lue)

骨髓是基礎研究和臨床治療所用MSCs的主要來源之一，但是獲取骨髓MSCs是有創的，且所獲細胞數量非常有限[13-15]。因此，人們一直在從更方便獲得和更優質兩方面努力尋找替代骨髓MSCs的新來源[16]。目前已從一些廢棄的組織，例如脂肪、乳牙、胎盤和臍帶中發現了M SCs[17]，但是這些MSCs是否可應用于臨床治療，以及如何從這些新來源中選出更優質的MSCs仍有待探索。

本實驗的取材主要是子宮肌層的內1/3，即子宮結合帶，又稱黏膜下肌層[18]，其平滑肌束與內膜基底層平行走行。核磁共振上顯示的子宮結合帶是分辨清晰的低信號帶影像，與結合帶內側的內膜高信號影像和結合帶外側的子宮外肌層中等信號影像界限清楚[19]。雖然子宮內膜MSCs具有高度增殖能力及自我更新分化潛能[20]，且近年來因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌等婦科疾病切除子宮的患者也逐漸增多，但是從子宮內膜基底層獲得的細胞仍很有限，且子宮內膜與外界相通，容易發生污染，尤其是對于陰道炎和宮頸HPV感染的患者，而子宮結合帶部分占子宮組織的1/3，是充足的組織來源，可以獲得足夠用于干細胞治療的細胞數量且不易發生污染。

本研究結果顯示，u JZSCs呈梭形、放射狀生長，貼壁能力強，MSCs表面標志物的表達多數在90%以上，成骨、成脂、成軟骨誘導分化能力強，從而證實從子宮結合帶分離出來的細胞為MSCs，符合國際鑒定MSCs的標準[1]。流式細胞術檢測細胞活率數據穩定，以細胞的流速評價細胞數量，聯合使用區分活細胞與死細胞的染料，可用于細胞存活率的測定[21]。從本研究結果來看，細胞成活率很高，為94.32%±0.96%，比較容易適應環境；從細胞周期結果來看，處于G2+S期的細胞百分比高，具有較強的增殖能力，在培養過程中，死亡細胞及細胞碎片少，是干細胞治療較為理想的來源。

綜上所述，本研究結果表明，可成功從子宮結合帶中分離出u JZSCs，且該干細胞表達典型的MSCs表面抗原，具有較強的增殖能力以成脂、成骨、成軟骨分化特性。此外，u JZSCs還具有組織充足，易分離，不易污染等優勢。對于u JZSCs的研究，目前尚處于起步階段，相關研究仍有待進一步深入。

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