妊娠期綿羊不同程度高原缺氧模型的建立

胡劼，李華，焦明克，段瀚宇

我國新疆地區有帕米爾、阿里兩大高原，有喀喇昆侖山、昆侖山、天山等多個平均海拔5000m以上的山系，高海拔地區總面積可達60萬平方千米，這些地區空氣稀薄，氧含量低，是高原缺氧疾病的高發地帶。研究顯示，當母體處于低氧環境，動脈氧分壓降為40mmHg時，其體內胎兒的動脈氧分壓可降至10～12mmHg，造成胎兒缺氧狀態[1]。這種狀態不僅造成胎兒血流和體內氧分子的重新分布，還可導致胎兒發生缺氧應激反應[2]，引發多種器官組織病理改變，從而引起胎兒生長受限、發育異常。研究還顯示，許多慢性成人疾病具有“胎兒起源”，即妊娠期缺氧會影響后代發展，增加后代在成年期患冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓及糖尿病等代謝性疾病的風險[3]，但目前還缺乏有效的研究妊娠期缺氧母體及胎兒改變的動物模型。為此本研究應用西北人工實驗艙建立妊娠期綿羊不同程度高原缺氧模型，并進行缺氧指標及氧化損傷標志物的檢測，評估判斷該造模方法的可行性并初步探討高原低氧環境對妊娠期母體及胎兒的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 西北地區特殊環境實驗艙(DYC-3013M)由蘭州軍區烏魯木齊總醫院研制。分光光度計(ND-NDL-US-CAN)、熒光計(FM 109534)購自Thermofisher公司。丙二醛TBARS定量分析試劑盒(STA-330)購自Cell BioLabs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及高原缺氧模型制備 人工授精配種成功的妊娠期綿羊24只，體重25～35kg，由蘭州軍區烏魯木齊總醫院實驗動物中心提供。將24只妊娠期綿羊隨機分為平原對照組(low altitude control group，LAC)組、輕度低氧暴露組(m ild hypoxia exposure group，MHE)組及重度低氧暴露組(severe hypoxia exposure group，SHE)共3組(n=8)。LAC組于平原環境人工實驗艙飼養，低氧暴露組于低壓高寒環境人工實驗艙中飼養，期間動物均自由飲水進食，MHE和SHE組均每隔24h開艙30m in添加水及飼料，低氧暴露持續整個妊娠期。其中，LAC人工實驗艙溫度為20℃，濕度11.0g/m3，O2含量260g/m3，壓力100.0kPa；MHE人工實驗艙溫度為5℃，濕度3.68g/m3，O2含量206g/m3，壓力67.7kPa，調節實驗艙內高度以10m/s的速度勻速上升至海拔3000m水平，以模擬西北地區海拔3000m環境；SHE人工實驗艙溫度為–6℃，濕度1.77g/m3，O2含量166g/m3，壓力54.1kPa，調節實驗艙內高度以10m/s的速度勻速上升至海拔5000m水平，以模擬西北地區海拔5000m環境。該人工實驗艙根據隨海拔升高，氣壓降低，空氣密度減小，空氣成分不變的物理原理，采用減壓裝置使密閉艙內壓力降低，密度減小，從而模擬所需的高原低氧環境。

1.2.2 動物模型氧合狀態評估 所有實驗動物檢測經皮血氧飽和度(SpO2)及動脈血氧飽和度(SaO2)。將空腹妊娠期綿羊臥位固定于解剖臺上，伸展后肢向外伸直，暴露腹股溝三角動脈搏動部位，剪毛，碘酒消毒。注射器抽取625U/m l肝素鈉0.2m l，轉動注射器使其內均勻附著肝素。左手手指觸及股動脈跳動處，穿刺動脈取鮮紅血液2m l，用干藥棉壓迫止血2～3m in。拔針同時立即排空氣泡，將針頭迅速刺入橡皮塞，平穩靜置送至檢驗科于2h內完成檢測。共檢測6次，時間點分別為進艙建模前(0d)及進艙建模后第7、15、30、90、120d。

1.2.3 動物模型一般情況監測 分別于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d連續觀測并記錄所有孕羊的體溫、呼吸、心率、血壓、飲食情況和行為運動情況。

1.2.4 氧化應激反應評價 分別于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d穿刺取妊娠期綿羊肝臟組織，所有取出組織(0.1～0.2g)以1:20的比例加入冰冷0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，用勻漿器在0～4℃下制成勻漿液，進行蛋白質氧化損傷的生物標志物羰基(carbonyl groups，CO)、細胞氧化損傷的生物標志物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的檢測，用于評價妊娠期綿羊缺氧模型體內的氧化損傷程度。其中，CO檢測采用分光光度法[4]，MDA檢測采用硫代巴比妥酸反應產物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)定量分析法，TBARS涵蓋了大部分氧化損傷導致的醛酮類物質，是衡量脂質過氧化的指標之一[5]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，兩組總體均數間比較采用t檢驗，組內各亞組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同海拔高度對妊娠期綿羊氧合狀態的影響觀察不同時間點妊娠期綿羊的SpO2(mm Hg)及SaO2(%)，結果顯示：在造模第0天和7天，3組動物間無統計學差異(P＞0.05)。從造模第15d開始直到造模第120天，MHE組及SHE組SpO2和SaO2水平明顯低于LAC組(P＜0.05)，且SHE組明顯低于MHE組(P＜0.05，表1)。按照30mmHg＜PaO2＜60mmHg且60%＜SaO2＜90%為輕度缺氧的診斷標準，造模30d時MHE動物造模成功；按照PaO2＜30mm Hg且SaO2＜60%為重度缺氧的診斷標準，造模90d時SHE動物造模成功。最終得出應用人工實驗艙模擬西北地區高原低氧氣候環境，建立輕度缺氧妊娠期綿羊模型的具體條件為溫度5℃，濕度3.68g/m3，空氣中O2含量206g/m3，壓力67.7kPa，高度以10m/s的速度勻速上升到海拔3000m水平，造模用時30d；建立重度缺氧妊娠期綿羊模型的具體條件為溫度–6℃，濕度1.77g/m3，空氣中O2含量166g/m3，壓

表1 3組妊娠期綿羊不同時間點SpO2(mmHg)及SaO2(%)結果對比(±s, n=8)Tab. 1 SpO2 (mmHg) and SaO2 (%) in pregnant sheep of 3 groups at different time points (±s, n=8)

LAC. Low altitude control group; MHE. M ild hypoxia exposure group; SHE. Severe hypoxia exposure group; (1)P＜0.05 compared with LAC;(2)P＜0.05 compared with MHE

Group 0d 7d 15d 30d 90d 120d SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 LAC 85±4 96±3 84±5 95±4 86±2 97±1 83±4 93±6 82±5 92±2 87±1 94±3 MHE 83±3 94±4 81±3 91±2 73±4(1) 83±5(1) 56±3(1) 72±2(1) 43±2(1) 67±4(1) 40±3(1) 70±2(1)SHE 86±2 95±3 79±5 90±1 44±3(1)(2) 70±6(1)(2) 29±2(1)(2) 55±1(1)(2) 24±1(1)(2) 42±3(1)(2) 22±4(1)(2)38±3(1)(2)

力54.1kPa，高度以10m/s勻速上升至海拔5000m水平，造模用時90d。

2.2 不同海拔高度對妊娠期綿羊生命體征及行為狀態的影響 建模前至建模后30d，各組妊娠期綿羊各項生命體征及一般情況變化不明顯；從建模后90d開始，MHE組及SHE組動物的呼吸頻率較LAC組降低(P＜0.05)，心率較LAC組升高(P＜0.05)，運動減少，SHE組動物的飲食較其他兩組減少；各組間妊娠期綿羊其余生命體征未發現明顯改變(表2)。

表2 建模后90d不同分組妊娠期綿羊生命體征及一般情況結果對比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

表2 建模后90d不同分組妊娠期綿羊生命體征及一般情況結果對比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

(1)P＜0.05 compared with LAC

Group Body temperature (℃) Breath (/m in) Heart rate (/m in)Systolic pressure (kPa) Diastolic pressure (kPa) Diet Movement LAC 37.7±0.5 18.0±2.0 70.0±4.0 15.9±0.7 9.3±0.9 Normal Normal MHE 36.3±0.4 14.0±2.0(1) 77.0±2.0(1) 17.3±0.5 10.5±0.4 Normal Reduced SHE 36.9±0.5 12.0±1.0(1) 78.0±3.0(1) 18.1±0.3 11.1±0.8 Reduced Reduced

2.3 不同海拔高度對妊娠期綿羊氧化應激的影響

圖1 建模后120d不同分組妊娠期綿羊氧化應激的生物標志物結果對比Fig.1 Results of oxidative stress biomarkers in 3 groups of gestational sheep 120 days after modeling(1)P＜0.05 compared with LAC group; (2)P＜0.05 compared with MHE group

建模前至建模后90d，MHE組及SHE組妊娠期綿羊的CO和MDA水平與LAC組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；從建模后120d開始，MHE組及SHE組妊娠期綿羊的CO和MDA水平均明顯高于LAC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，且SHE組CO、MDA水平明顯高于MHE組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖1)。

3 討 論

醫學上將海拔高度為3000m以上的地區稱為高原。我國高原地域遼闊，占全國土地總面積的26%[6]。這些地區空氣稀薄，低溫低氧，這種高原低氧環境在系統水平、器官水平、細胞水平、分子水平甚至基因水平都可對人體功能產生多種負面影響。

高原低氧環境對妊娠期母體和胎兒都會產生巨大影響。嚴重的長時間氧氣供應不足會導致胎兒腦組織發生不可逆的損傷[7]。缺氧可導致胎兒消化道黏膜損傷，引起新生兒壞死性小腸結腸炎。缺氧引起的酸中毒會導致胎兒的心臟糖原耗竭，顯著降低其心臟的能量和氧氣供應。缺氧可誘導胎兒體內基質金屬蛋白酶(MMPs)表達失衡[8]，炎性細胞因子表達上調，引發胎兒大腦和心臟組織重塑、心肌雙核化過程延遲[9]，這些都會導致胎兒生長和發育的異常。

目前關于高原低氧環境對妊娠期母體及胎兒影響的研究還比較有限，一是因為高原環境惡劣，現場研究不便于實施，二是因為尚未建立較為簡便有效的動物模型供研究使用?；诖?，本研究通過調整人工實驗艙溫度、濕度、壓力和氧含量等指標，最大化地模擬西北地區高原低氧環境，成功制備出不同程度的妊娠期綿羊缺氧動物模型。本研究結果顯示，在模擬西北高原低氧環境的人工實驗艙中飼養90d后，妊娠期綿羊出現呼吸頻率減低、心率加快、運動及飲食減少的現象，且不同程度低氧環境暴露下，妊娠期綿羊的SpO2、SaO2水平，飲食情況及氧化損傷程度不同，表明缺氧環境造成了動物生命體征和行為的改變，與之前的一些研究報道相符[1,10]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(react ive nit rogen species，RNS)是引起蛋白質氧化損傷的重要因素[11-13]，可通過多種代謝途徑產生，易與細胞內的大分子物質反應，引起細胞結構的廣泛病理損傷[3]。因此通過檢測由自由基介導的蛋白質及脂質氧化產物可評估體內是否發生了氧化性損傷[14]。在模擬西北高原低氧環境的人工實驗艙中飼養120d后，妊娠期綿羊肝組織內氧化應激生物標志物CO、MDA含量上升，表明高原低氧環境誘發了動物體內的氧化應激反應，引起妊娠期母體體內蛋白質和脂質的氧化損傷。

本研究結果表明，在平原地區也可以通過對人工實驗艙的各項參數進行精確控制，完成所需的高原特殊環境下動物模型的制備，省錢省力，操作簡單，便于推廣。我們在造模過程中還觀察到在高原低氧環境下妊娠期綿羊多項指標的改變，提示妊娠期缺氧對母體內環境產生了較大影響，后續實驗中，我們還將通過檢測胎兒蛋白質組學和基因組學的改變，繼續觀察高原低氧環境對不同妊娠期母體綿羊體內胎兒心血管系統、泌尿系統和生殖系統發育的具體影響，以期為妊娠期高原缺氧性疾病的發病機制及干預研究提供理論依據。

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