H2S對煙霧吸入肺損傷大鼠的抗氧化作用研究

韓志海，張燕，段蘊鈾，姜毅，王曉陽，方庭正，黃燕

·短篇報道·

H2S對煙霧吸入肺損傷大鼠的抗氧化作用研究

韓志海，張燕，段蘊鈾，姜毅，王曉陽，方庭正，黃燕

煙霧吸入損傷；氧化性應(yīng)激；硫化氫

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD大鼠24只，體重150～250g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0004]提供，海軍總醫(yī)院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0012]飼養(yǎng)。按照隨機化原則將動物分為對照組、煙霧組、煙霧+H2S 3h組、煙霧+H2S 6h組，每組6只。

1.2 實驗方法 按照本課題組已成功建立的方法進行大鼠煙霧吸入性肺損傷模型制作，煙霧組、煙霧+H2S 3h組、煙霧+H2S 6h組各取2只大鼠分別置入吸煙瓶中，至出現(xiàn)呼吸深慢、張口喘鳴時或滿2min時限時，停止煙霧吸入，立即敞開吸煙瓶口，使其吸入空氣7min。重復(fù)上述步驟3～5次，至大鼠吸入空氣7min仍舊昏迷不醒時結(jié)束。

在煙霧吸入后，煙霧+H2S 6h組大鼠予以6h持續(xù)吸入H2S 80mg/L+30%O2，煙霧+H2S 3h組大鼠予以3h持續(xù)吸入H2S 80mg/L+30%O2，對照組、煙霧組予以吸入30% O26h。實驗結(jié)束大鼠予以安樂死，分離肺葉，右肺上、下葉分別置液氮凍存，右肺中葉4%多聚甲醛溶液浸泡72h后常規(guī)石蠟包埋。

1.3 ELISA檢測 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測右肺下葉勻漿中谷胱甘肽(GSH)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)濃度，具體步驟按試劑盒說明操作。

1.4 免疫組化法檢測右肺中葉肺組織NF-κBp65、Nrf2(nuclear factor-E2 related factor)含量 右肺中葉肺組織石蠟切片厚度3μm，60～65℃烤片4h，脫蠟，水化，PBS洗滌，高壓修復(fù)組織抗原，3%H2O2滅活過氧化物酶，正常山羊血清封閉，分別滴加第一抗體anti-NF-κBp65 antibody (Abcam，ab16502)、Anti-Nrf2 antibody (Abcam，ab31163)各50μl，稀釋至1:200，4℃孵育過夜，PBS洗3次，滴加復(fù)合二抗HRP-Polymer anti Mouse/Rabbit IgG(Maixin.Bio，KIT-5020)，室溫靜置20min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照以血清代替一抗。鏡檢黃色或棕黃色染色判為陽性。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)進行半定量分析，IPP6.0軟件分析得出每個視野陽性染色的平均光密度(mean density)、積分光密度(integrated optical density，IOD)的總和即累積光密度(sum IOD)，計算出每個標(biāo)本上述指標(biāo)的均值，從而對染色結(jié)果進行半定量分析。

1.5 肺組織γ-GCS mRNA的定量檢測 采用熒光定量PCR法檢測大鼠右肺上葉γ-GCS mRNA。引物由嘉美生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，上游5'-GCATTC ATTTCACCCTGTTCT-3'，下游5'-ACAAAGAGCCC TGACCTAATG-3'，擴增產(chǎn)物長度132bp。用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本總RNA。用HiFi-MMLVc DNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)進行反轉(zhuǎn)錄，用Ultra SYBR Mixture(with Rox)(CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0956)進行擴增。反應(yīng)條件為：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt法計算產(chǎn)物的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織勻漿檢測結(jié)果 煙霧組大鼠肺組織勻漿中GSH濃度較對照組明顯降低(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組GSH濃度較煙霧組明顯降低(P<0.001)。煙霧組大鼠γ-GCS濃度較對照組明顯升高(P<0.01)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組γ-GCS濃度與煙霧組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。煙霧組γ-GCS mRNA的相對表達量較對照組明顯增高(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組γ-GCS mRNA的相對表達量較煙霧組明顯降低(P<0.001，表1)。

2.2 大鼠肺組織Nrf2及NF-κBp65的免疫組化檢測及半定量分析結(jié)果 煙霧組大鼠肺組織Nrf2平均光密度與累積光密度較對照組明顯增高(P<0.05)，煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組較煙霧組明顯降低(P<0.05)。煙霧組大鼠肺組織NF-κBp65的累積光密度較對照組明顯增高(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組較煙霧組明顯降低(P<0.05)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1 大鼠肺組織勻漿GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

表1 大鼠肺組織勻漿GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.01 compare with smoking group; (2)P<0.01 compare with control group

表2 大鼠肺組織NF-κBp65、Nrf2免疫組化檢測及半定量結(jié)果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

表2 大鼠肺組織NF-κBp65、Nrf2免疫組化檢測及半定量結(jié)果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.05 compare with smoking group; (2)P<0.05 compare with control group

3 討 論

本研究中煙霧組Nrf2及γ-GCS mRNA的表達、γ-GCS濃度均較對照組明顯增高，提示煙霧吸入后抗氧化應(yīng)激體系激活，以對抗氧化應(yīng)激損傷；煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組Nrf2、γ-GCS mRNA的表達較煙霧組降低，但γ-GCS的濃度與煙霧組比較無明顯變化，GSH濃度較對照組明顯降低，提示吸入H2S可抑制機體自身的抗氧化體系，推測原因為H2S作為強還原性物質(zhì)，經(jīng)氣道吸入后可與氧化劑發(fā)生中和反應(yīng)，直接參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制機體自身的抗氧化體系[1]。H2S至少能與超氧陰離子、過氧化氫、超氧化氮及次氯酸四種氧自由基發(fā)生反應(yīng)[2-3]，保護膜結(jié)構(gòu)免受自由基的損傷。H2S通過蛋白質(zhì)巰基化機制，抑制機體抗氧化體系的過度激活，從而減少能量消耗，為機體度過急性損傷期保存能量。

[1]Liu YF, Tang HW, Wu XL, et al. Reproduction and evaluation of a rat model of inhalation lung injury caused by black gunpowder smog[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(8): 670-674. [劉一凡, 唐紅衛(wèi), 吳小利, 等. 黑火藥煙霧致吸入性肺損傷大鼠模型的建立與評價[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(8): 670-674.]

[2]Krupa A, Fudala R, Stankowska D, et al. Anti-chemokine autoantibody: chemokine immune complexes activate endothelial cells via IgG receptors[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009, 41(2): 155-169.

[3]van der Heijden M, van Nieuw Amerongen GP, Koolwijk P, et al. Angiopoietin-2, permeability oedema, occurrence and severity of ALI/ARDS in septic and non-septic critically ill patients[J]. Thorax, 2008, 63(10): 903-909.

R563.9

A

0577-7402(2015)05-0425-02

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.20

2015-03-27；

2015-04-15)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

全軍“十二五”醫(yī)學(xué)科研課題(CWS11J180)

100048 北京 海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科(韓志海、張燕、段蘊鈾、王曉陽、方庭正、黃燕)；110032 沈陽 沈陽軍區(qū)政治部門診部(姜毅)

張燕，E-mail: changyan511@sohu.com