肺癌患者外周血調節性B細胞的表達及其臨床意義

陳葆國，梅麗萍，鄭瑞，李伯利

肺癌患者外周血調節性B細胞的表達及其臨床意義

陳葆國，梅麗萍，鄭瑞，李伯利

目的 檢測肺癌患者外周血調節性B細胞(CD19+CD5+CD1d+B細胞，Bregs)的表達及其臨床意義。方法收集72例肺癌患者和29例健康體檢者的外周血，采用流式細胞儀檢測Bregs細胞數量，ELISA法檢測外周血清IL-10和TGF-β的水平。比較肺癌患者與健康對照，肺癌Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ+Ⅳ期患者Bregs細胞比例、外周血IL-10和TGF-β水平的差異；分析肺癌患者Bregs細胞比例與外周血IL-10和TGF-β水平的相關性。結果 肺癌患者外周血Bregs細胞比例明顯高于健康對照 (5.01%±1.20% vs 2.78%±0.56%，P＜0.01)，Ⅲ+Ⅳ期患者高于Ⅰ+Ⅱ期患者(5.63%±1.04% vs 4.13%±0.78%，P＜0.01)。肺癌患者外周血清IL-10和TGF-β水平明顯高于健康對照(2.34±0.79pg/ml vs 1.29±0.51pg/ml，56.64±6.93ng/ ml vs 22.42±4.42ng/ml，P＜0.01)，Ⅲ+Ⅳ期患者高于Ⅰ+Ⅱ期患者(2.79±0.60pg/ml vs 1.71±0.59pg/ml，59.88±6.63ng/ml vs 52.10±4.37ng/ml，P＜0.01)。相關分析顯示，肺癌患者外周血Bregs細胞比例與IL-10水平呈正相關(r=0.69，P<0. 01)，而與TGF-β水平無明顯相關性。結論 肺癌患者外周血Bregs細胞比例及血清IL-10、TGF-β水平增高，提示Bregs細胞可能與肺癌的進展相關。

肺腫瘤；B淋巴細胞，調節性；白細胞介素10；轉化生長因子β

肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，臨床生存期短，目前發病機制仍不清楚。近年研究表明免疫系統功能失衡可導致肺癌的發生發展[1-4]。最近有研究顯示調節性B細胞(regulatory B cells，Bregs)參與了機體的免疫耐受調節，與腫瘤免疫逃逸密切相關[1]。Bregs有多種亞型[5]，其中CD19+CD5+CD1d+亞型主要分泌抑制性細胞因子IL-10，其分泌的IL-10占B細胞來源IL-10的絕大部分，故CD19+CD5+CD1d+亞型又被稱為B10細胞。除主要分泌IL-10的Bregs以外，還有一類主要分泌TGF-β的Bregs，具有獨特的生物學功能。本研究通過檢測肺癌患者外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞亞群的表達情況，探討其在肺癌患者免疫調節中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2011年5月－2013年12月在浙江省臺州醫院呼吸科和胸外科住院的72例肺癌患者的臨床資料，其中男43例，女29例，年齡41～79(中位值64)歲。72例中鱗癌42例，腺癌19例，小細胞癌11例。根據2009年國際抗癌組織聯盟(UICC)的分期標準[2]，Ⅰ期12例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例。入選患者均為初治，經細胞學或病理學證實為肺癌且不伴自身免疫性疾病，未經化療及其他生物治療。29名健康志愿者作為對照組，性別、年齡均與肺癌組匹配。所有入組患者和對照者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 CD19-Percp-Cy5.5、CD1d-PE、CD5-FITC、IgG2a-FITC、IgG1-PE單克隆抗體購自美國BD公司；IL-10、TGF-β ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。固定液：1%多聚甲醛。流式細胞儀FACScantoⅡ購自美國BD公司。

1.3 標本采集、處理及檢測 所有觀察對象均在清晨空腹采集不抗凝靜脈血3ml，分離血清，–20℃保存，同時采集EDTA抗凝靜脈血2ml。①取 Falcon 管2支，標記A和B，A管加CD19-Percp-Cy5.5、IgG2a-FITC、IgG1-PE各10μl，加抗凝血60μl，B管加CD19-Percp-Cy5.5、CD1d-PE、CD5-FITC各10μl，加抗凝血60μl，震蕩混勻，20℃避光15min；②A、B管加紅細胞裂解液2ml，震蕩混勻，20℃避光15min；③取A、B管1000r/min離心6min，去上清，加PBS 2ml，再離心6min，去上清，加1%多聚甲醛0.5ml，采用流式細胞儀檢測。

1.4 外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs和IL-10、TGF-β水平的檢測 CD19+CD5+CD1d+Bregs檢測：應用流式細胞儀DIVA分析軟件。在CD19/SSC散點圖上設CD19+細胞門，分析CD19+CD5+、CD19+CD5+CD1d+細胞亞群，結果以其占CD19+B淋巴細胞的百分比表示。IL-10、TGF-β水平的檢測：應用ELISA法檢測血清IL-10、TGF-β水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學處理 流式細胞儀所得數據采用DIVA軟件進行分析。計量資料呈正態分布，以±s表示， 應用SPSS 18.0軟件進行數據處理，組間比較采用單因素方差分析。相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺癌患者的臨床病理特征 72例肺癌患者中，≥60歲38例，<60歲34例；高分化20例，中低分化52例；有淋巴結轉移者50例，無淋巴結轉移者22例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期30例，Ⅲ、Ⅳ期42例；腫瘤≥5cm 49例，<5cm 23例。

2.2 CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞檢測結果

2.2.1 肺癌組與對照組比較結果 72例肺癌患者外周血CD19+CD5+B淋巴細胞和CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞占CD19+B細胞的比例分別為5.48%±0.89%、5.01%±1.20%，明顯高于對照組(3.99%±0.52%和2.78%±0.56%，t=8.38、9.58，P<0.01，圖1，表1)。

表1 肺癌患者與健康對照Bregs亞群及IL-10、TGF-β表達比較(±s)Tab.1 Comparison of Bregs subset ratios, IL-10 and TGF-β levels in lung cancer patients and healthy controls (±s)

表1 肺癌患者與健康對照Bregs亞群及IL-10、TGF-β表達比較(±s)Tab.1 Comparison of Bregs subset ratios, IL-10 and TGF-β levels in lung cancer patients and healthy controls (±s)

(1)P<0.01 compared with control group

?

2.2.2 肺癌組亞組分析 Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者外周血CD19+CD5+B淋巴細胞和CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞比例(5.85%±0.84%、5.63%±1.04%)均明顯高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(4.95%±0.65%、4.13%±0.78%)，差異有統計學意義(t=4.92、6.67，P<0.01，表2)。

2.3 外周血IL-10、TGF-β水平檢測結果

2.3.1 肺癌組與對照組比較結果 肺癌組患者血清IL-10、TGF-β水平(2.34±0.79pg/ml、56.64±6.93ng/ml)明顯高于對照組(1.29±0.51pg/ ml、22.42±4.42ng/ml)，差異有統計學意義(t=6.56、24.59，P<0.01)。

2.3.2 肺癌組亞組分析 Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者血清IL-10、TGF-β水平(2.79±0.60pg/ml、5 9.8 8±6.6 3 ng/m l)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者(1.71±0.59pg/ml、52.10±4.37ng/ml)，差異有統計學意義(t=7.58、5.62，P<0.01)。

2.4 肺癌組患者CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞與細胞因子的相關性分析 直線相關分析顯示，肺癌患者外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞比例與血清IL-10的水平呈正相關(r=0.69，P<0.01)，與TGF-β無明顯相關性(r=0.22，P﹥0. 05)。

圖1 肺癌患者CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞流式分析圖Fig.1 Determination of Bregs (CD19+CD5+CD1d+B cells) by flow cytometry

表2 不同分期肺癌患者Bregs亞群及IL-10、TGF-β表達比較(±s)Tab.2 Bregs subset ratios, IL-10 and TGF-β levels in lung cancer patients according to clinical staging (±s)

表2 不同分期肺癌患者Bregs亞群及IL-10、TGF-β表達比較(±s)Tab.2 Bregs subset ratios, IL-10 and TGF-β levels in lung cancer patients according to clinical staging (±s)

(1)P﹤0. 01 compared with stage Ⅰ+Ⅱ

3 討 論

Mizoguchi等[6]首先命名了調節性B細胞，并在炎癥性腸病模型中證實Bregs細胞是一種新的免疫耐受細胞亞群。在近年來的研究中Bregs的生理功能逐漸被揭示[7-8]：Bregs細胞主要通過分泌IL-10或TGF-β等抑制性細胞因子，調控效應性T細胞、細胞毒性T細胞、NK細胞、調節性T細胞(Tregs)、樹突細胞等免疫活性細胞的功能，維護機體免疫平衡。在自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤等疾病中該免疫平衡往往有所失調。既往文獻報道，Bregs細胞免疫表型呈多樣性[5]，而最能代表B10細胞的免疫表型是CD19+CD5+CD1d+的Bregs亞群[9]，因其表達的標記均位于細胞膜，樣本處理簡單、快速，適合于臨床大樣本研究，但目前在腫瘤患者中報道較少。

有研究顯示，食管癌患者外周血CD5+CD19+Bregs細胞較健康對照組明顯增多，且Ⅲ、Ⅳ期患者高于Ⅰ、Ⅱ期患者，手術切除腫瘤后Bregs細胞明顯降低，提示其與腫瘤負荷有關[10]。本研究結果顯示，肺癌患者外周血CD19+CD5+B細胞和CD19+CD5+CD1d+調節性B細胞亞群比例較健康對照均顯著增高，且Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者外周血中CD19+CD5+B細胞和CD19+CD5+CD1d+調節性B細胞比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，與文獻報道一致。提示肺癌患者CD19+CD5+CD1d+調節性B細胞亞群比例增高，并隨著疾病進展(腫瘤負荷增加)而增高。

Shi等[10]研究發現食管癌患者手術前Bregs分泌的IL-10和TGF-β較對照組增多，手術腫瘤負荷移除后TGF-β明顯減少，而CD19+IL-10+細胞較術前增加；同樣，在肝癌患者術后1d及7d也發現CD19+IL-10+細胞數量增加[11]，因為手術解除了B10細胞的抑制功能。Olkhanud等[12]報道在乳腺癌小鼠模型(4T1)中存在腫瘤誘導的Bregs(tBregs)亞群，tBregs具有獨特的生物學功能，同時分泌TGF-β和IL-10，而大量分泌TGF-β是其主要特征，TGF-β誘導Treg增殖，促進腫瘤細胞肺轉移。本研究結果顯示，肺癌患者外周血血清IL-10和TGF-β水平較健康對照組增高，且Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者較Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者更高。相關性分析顯示，CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞亞群比例與IL-10水平呈正相關，提示肺癌患者CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞亞群主要分泌IL-10，且IL-10水平隨著腫瘤負荷增加而升高，與肺癌的發病及進展密切相關。但本研究結果顯示，肺癌患者CD19+CD5+CD1d+Bregs比例與TGF-β水平無明顯相關性，推測可能是因為高分泌TGF-β的Bregs細胞并不包含在CD19+CD5+CD1d+Bregs亞群中，但其具體機制還有待進一步研究確認。

Bregs細胞發揮腫瘤免疫逃逸調節機制可能主要涉及以下途徑：一方面，Bregs細胞上的CD40與腫瘤細胞上的CD40L相互作用，誘導Bregs細胞分泌IL-10[13-14]，抑制CD8+T細胞的生物學活性，下調CD8+T細胞和NK細胞分泌IFN-γ。將腫瘤細胞與B淋巴細胞缺陷小鼠的脾細胞共同培養，CD8+T細胞和NK細胞能分泌IFN-γ，但如果在共同培養時加入純化的正常小鼠B淋巴細胞或IL-10，則IFN-γ 的分泌就會減少，提示Bregs細胞或其產生的IL-10可抑制淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[5]。另一方面，tBregs細胞大量分泌的TGF-β可誘導CD4+效應性T細胞轉化成調節性T細胞，促進腫瘤細胞的增殖、轉移。應用特異性抑制物3'4'5三羥基芪(resveratrol，RSV)能有效抑制tBregs的增殖[15-16]，TGF-β表達水平隨之降低，小鼠腫瘤縮小，顯示出良好的潛在抗腫瘤免疫治療前景。

綜上所述，肺癌患者外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs細胞增多，可能會抑制患者體內抗腫瘤免疫活性細胞的功能。因此，臨床上檢測Bregs細胞可能有助于腫瘤的診斷和預后判斷。此外，若能夠特異性去除Bregs，可能會有效增強機體的抗腫瘤免疫反應，將是一種有前景的腫瘤免疫治療方法。

[1]Olkhanud PB, Damdinsuren B, Bodogai M, et al. Tumorevoked regulatory B cells promote breast cancer metastasis by converting resting CD4+T cells to T-regulatory cells[J]. Cancer Res, 2011, 71(10): 3505 -3515.

[2]Detterbeck FC, Boffa DJ, Tanoue LT. The new lung cancer staging system[J]. Chest, 2009, 136(1): 260-271.

[3]Sharma S, Yang SC, Zhu L, et al. Tumor cyclooxygenase-2/ prostaglandin E2-dependent promotion of FOXP3 expression and CD4+T regulatory cell activities in lung cancer[J]. Cancer Res, 2005, 65(12): 5211-5220.

[4]Song Y, Yang W. Medical treatment of advanced non-small cell lung cancer: progress in 2014[J]. Med J Chin PLA, 2015, 40(1): 10-15. [宋勇, 楊雯. 2014年晚期非小細胞肺癌內科治療進展[J]. 解放軍醫學雜志, 2015, 40(1): 10-15.]

[5]Chou H, Wang LX. The research progress of regulatory B cells[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2013, 29(6): 655-657. [仇昊,王立新. 調節性B細胞的研究進展[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(6): 655-657.]

[6]Mizoguchi A, Mizoguchi E, Smith RN, et al. Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor a mutant mice[J]. J Exp Med, 1997, 186(10): 1749-1756.

[7]Den Haan JM, Kraal G, Bevan MJ. Cutting edge: Lipopolysac charideinduces IL-10-producing regulatory CD4+T cells that suppress the CD8+T cell response[J]. J Immunol, 2007, 178(9): 5429-5433.

[8]Wei YX, Zhou WQ, Xiao L, et al. Effect of regulatory dendritic cells on IL-10-producing regulatory B cells of skin allograft in mice[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(4): 274-278. [魏玉香, 周文強, 肖漓, 等. 調節性樹突細胞對皮膚移植小鼠IL-10+調節性B細胞的影響[J]. 解放軍醫學雜志, 2013, 38(4): 274-278.]

[9]Noh G, Lee JH. Regulatory B cells and allergic diseases[J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2011, 3(3): 168-177.

[10]Shi J, Li S, Zhou Y, et al. Perioperative changes in peripheral regulatory B cells of patients with esophageal cancer[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(3): 1525-1530.

[11]Chen T, Song D, Min Z, et al. Perioperative dynamic alterations in peripheral regulatory T and B cells in patients with hepatocellular carcinoma[J]. J Transl Med, 2012, 25(10): 14.

[12]Olkhanud PB, Damdinsuren B, Bodogai M, et al. Tumorevoked regulatory B cells promote breast cancer metastasis by converting resting CD4+T cells to T-regulatory cells[J]. Cancer Res, 2011, 71(28): 3505-3515.

[13]Balkwill F, Montfort A, Capasso M. B regulatory cells in cancer[J]. Trends Immunol, 2013, 34(4): 169-173.

[14]Inoue S, Leitner WW, Golding B, et al. Inhibitory effects of B cells on antitumor immunity[J]. Cancer Res, 2006, 66(15): 7741-7747.

[15]Lee-Chang C, Bodogai M, Martin-Montalvo A, et al. Inhibition of breast cancer metastasis by resveratrol-mediated inactivation of tumor-evoked regulatory B cells[J]. J Immunol, 2013, 191(8): 4141-4151.

[16]Biragyn A, Lee-Chang C, Bodogai M. Generation and identification of tumor-evoked regulatory B cells[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1190(5): 271-289.

Expression of the regulatory B cells in peripheral blood of patients with lung cancer and its clinical significance

CHEN Bao-guo, MEI Li-ping, ZHENG Rui*, LI Bo-li
Central Laboratory, Department of Hematology of Affiliated Taizhou Hospital, Taizhou, Zhejiang 317000, China
*

, E-mail: zhengrui80@aliyun.com
This work was supported by the New Century 151 Talent Project Fund of Zhejiang Province (Taizhou Renshe [2011]121)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of regulatory B cells (Bregs) in peripheral blood of patients with lung cancer.MethodsThe peripheral blood was collected from 72 patients with lung cancer and 29 healthy subjects (as control), and the Bregs subsets (CD19+CD5+CD1d+) were detected by flow cytometry, the levels of IL-10 and TGF-β in serum were determined by ELISA. Proportion of Bregs and peripheral blood levels of IL-10 and TGF-β were compared between lung cancer patients and healthy controls, and between the lung cancer patients in stage Ⅰ+Ⅱ and those in stage Ⅲ+Ⅳ. The correlation between Bregs proportion and peripheral blood levels of IL-10 and TGF-β were further investigated.ResultsThe percentage of Bregs was significantly higher in the peripheral blood of lung cancer patients than that of healthy controls (5.01%±1.20% vs 2.78%±0.56%, P<0.01). The proportion of Bregs was found to be increased in patients in clinical Ⅲand Ⅳ stages (5.63%±1.04%) compared with those in clinical Ⅰ and Ⅱ stages (4.13%±0.78%, P<0.01). The IL-10 and TGF-β levels were obviously higher in lung cancer patients than those in healthy controls (2.34±0.79pg/ml vs 1.29±0.51pg/ml, and 56.64±6.93ng/ml vs 22.42±4.42ng/ml, respectively, P<0.01), and in patients in Ⅲ and Ⅳ stages than those in patients in Ⅰ and Ⅱ stages (2.79±0.60pg/ml vs 1.71±0.59pg/ml, and 59.88±6.63ng/ml vs 52.10±4.37ng/ml, respectively, P<0.01). There was a positive correlation between the proportion of Bregs and the levels of IL-10 (r=0.69, P<0.01), but no significant correlation was found between the proportion of Bregs and the levels of TGF-β.ConclusionIncreased proportion of Bregs and levels of serum IL-10 and TGF-β in lung cancer patients may imply that the Bregs are probably associated with the progression of lung cancer.

lung neoplasms; B-lymphocytes, regulatory; interleukin-10; transforming growth factor beta

R734.2

A

0577-7402(2015)05-0396-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.13

2014-11-07；

2015-03-03)

(責任編輯：沈寧)

浙江省新世紀151人才工程基金(臺人社發[2011]121號)

陳葆國，主任技師。主要從事腫瘤發病機制方面的研究

317000 浙江臺州 浙江省臺州醫院中心實驗室(陳葆國、梅麗萍、鄭瑞、李伯利)[通訊作者]鄭瑞，E-mail：zhengrui80@aliyun.com