半導體聚合物納米熒光探針的制備及生物應用研究進展

張佳楠，常開文，李 瓊，孫 凱，尹升燕，吳長鋒

(集成光電子學國家重點聯合實驗室吉林大學實驗區吉林大學電子科學與工程學院，吉林長春 130012)

1 引 言

熒光成像技術是生命醫學領域的重要研究工具［1-2］。新型熒光成像技術可以在單分子水平上探測生物分子間的相互作用，也可以對亞細胞結構進行納米分辨率的成像;另外還可用于監測基因表達、蛋白質運輸和信號傳導等細胞活動［3-7］。熒光探針的亮度和穩定性是決定熒光成像技術的靈敏度和檢測限的重要因素。傳統的有機染料分子做熒光標記時，其熒光亮度低和光穩定性差等缺點已經限制了現代熒光成像技術的進一步發展和應用。因此，開發新型熒光標記材料及技術成為化學、材料科學和生物醫學等多學科交叉領域的研究熱點。

在近十幾年中，熒光納米粒子在材料科學和生物醫學等領域引起了廣泛關注［8-9］。其中小尺寸的熒光納米粒子在生物學應用中具有獨特的優勢，為此人們開發了各式各樣的小尺寸量子點(Quantum dots，Qdots)，如無機半導體量子點、硅量子點、碳量子點和摻雜了染料的二氧化硅納米粒子等［10-13］。經過表面包覆和生物功能化，無機量子點已經在生物醫學成像研究中展示了重要應用［14-15］。以CdSe/ZnS為代表的無機半導體量子點由于量子尺寸效應而表現出獨特的光學特性，而且可以通過調整量子點的尺寸獲得各種發射波長。這種納米標記探針具有吸收譜帶寬、發射譜帶窄、光譜對稱、光化學性質穩定等性質。CdSe/ZnS量子點可以克服有機小分子染料光穩定性差的缺點，但是無機半導體材料一般含有重金屬離子，其天然的毒性大大限制了這類量子點在生物活體成像和臨床醫學的實際應用。

有機半導體聚合物是一類因共軛電子而產生半導體性質的高分子材料，已被廣泛應用于光電器件［16-17］。近年來，半導體聚合物在高靈敏的化學和生物傳感器領域獲得了廣泛應用［18-20］。半導體聚合物具有光學吸收截面大、熒光量子效率高、輻射躍遷速率快等特性，這些優異的光學性質特別適合于開發生物應用方面的納米熒光探針。目前人們已經開發了各種疏水聚合物、親水聚合物和兩親性聚合物的熒光納米粒子［21-25］。這些聚合物納米粒子的熒光特性和膠體穩定性依賴于其自身的尺寸、組分、內部結構和表面特性等。

在眾多種類的半導體聚合物納米粒子中，尺寸大小和Qdots相當的半導體聚合物納米粒子通常被稱為聚合物量子點(Polymer dots，Pdots)［26］。這些小尺寸高亮度的聚合物量子點可以通過表面功能化與生物分子偶聯，從而在生物醫學應用中發揮重要作用［27-33］。本文概述了聚合物量子點的制備方法、熒光性質、表面功能化以及在生物應用等領域最近的進展。重點介紹聚合物量子點在細胞標記、體內成像、生物傳感、單粒子示蹤、藥物輸送和光動力學療法等領域的應用。

圖1 常見的半導體聚合物的化學結構Fig.1 Chemical structures of common semiconducting polymers

2 半導體聚合物量子點

通常情況下，在具有π-共軛結構的高分子中，電子云重疊使得π電子可以沿主鏈移動。這些π-共軛聚合物在本征態通常是寬帶隙的半導體，因此可以稱它們為半導體聚合物。這種聚合物的熒光特性可以用半導體能帶理論來解釋:在光激發下，電子從最高占據能帶躍遷到最低空能帶，被激發的電子和空穴形成了束縛態(激子);電子-空穴對的帶間輻射復合導致輻射出光子。半導體聚合物的吸收波長由禁帶寬度決定，因此通過改變聚合物的分子結構，人們可以獲得可調吸收波長的半導體聚合物。目前開發出的半導體聚合物納米粒子的發射波長可以遍及可見光譜［34］。

圖1是近幾年研究較多的幾種半導體聚合物的化學結構。

2.1 半導體聚合物量子點的制備

一般來說，Pdots可以從低分子量的單體合成，也可以從高分子量的聚合物直接制備［35-37］。前者通常采用過渡金屬催化偶聯反應來獲得，相比之下，后者可以直接使用市售的半導體聚合物，而且不需要特定的儀器設備和有機高分子合成方面的專業技術。目前，Pdots主要采用后一種方法制備。從高分子量的聚合物直接制備Pdots的典型方法包括微乳液法和再沉淀法。由于Pdots目前主要應用于生物學研究中，因此最后的溶劑通常選擇水。在不同的制備方法中，半導體聚合物溶液的初始有機溶劑有一定的區別:在微乳液法中，半導體聚合物納米粒子是在乳化液液滴中形成的，這就要求初始有機溶劑是不溶于水的;在再沉淀法中，半導體聚合物溶液迅速與水混合，這就需要一個與水混溶的初始有機溶劑。Landfester等［38-39］首次采用微乳液法制備了半導體聚合物納米粒子。他們在制備過程中將半導體聚合物溶解在與水不互溶的有機溶劑(如氯仿)中，這種有機溶劑與添加了表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)的水混合之后，將有機溶劑蒸發，可以獲得穩定的聚合物納米粒子的水溶液。Masuhara等［40］使用再沉淀法制備了聚噻吩納米粒子，后來Mc-Neill研究組［27-30］將這種方法進行改良后，首次制備了可以作為高亮度成像探針的Pdots。在再沉淀過程中，溶解聚合物的有機溶劑迅速與水混合，混合后聚合物溶解度突然下降，在聚合物鏈間或單鏈段之間疏水作用的影響下，最終形成了高熒光亮度的Pdots懸浮液。

2.2 半導體聚合物量子點的表面功能化

為了使Pdots應用于實際的生物學研究，還需要對其進行表面功能化。類似于Qdots的功能化方法，最初的研究是利用包覆的方法在納米粒子的表面修飾相應的官能團，后來發現這種方法對Pdots的粒徑和單粒子亮度有一定的影響［41］。例如PLGA聚合物或者磷脂包覆的Pdots的尺寸對于細胞和亞細胞結構來說過于巨大，而且這種方法得到的納米粒子中半導體聚合物的含量較少，因此納米粒子的吸收截面受到限制［42］。對于表面包覆二氧化硅的Pdots，2～3 nm厚的二氧化硅外殼可能會在生物環境中逐漸水解［43］。所以，需要開發更加有效的方法來實現Pdots的表面功能化，同時保證納米粒子尺寸適用于細胞標記。

Chiu課題組［44-45］成功地實現了針對Pdots的表面功能化，并將其用于特異性的細胞靶向標記研究中。他們將少量具有兩親性功能基團的高分子與半導體聚合物預先共混在有機溶劑中，再利用聚合物的鏈間相互作用制備了表面帶有功能基團的Pdots。Chiu等使用的兩親性梳狀聚合物為PS-PEG-COOH，在前驅體溶液中保持半導體聚合物PFBT的濃度恒定，使PS-PEG-COOH相對于PFBT的質量百分含量控制在10% ～20%，然后利用再沉淀法制備功能化的PFBTPdots。圖2(a)是利用動態光散射(DLS)測得的表面修飾的PFBT Pdots流體動力學直徑分布圖，圖2(b)是表面修飾的PFBT Pdots的透射電鏡照片。由圖2(a)和圖2(b)可知上述方法得到的納米粒子粒徑約為15 nm，形貌呈球形。在后續的實驗中通過抗原-抗體或生物素-鏈霉親和素相互作用將功能化的Pdots對細胞膜的受體分子進行特異性標記。

圖2 (a)表面修飾的PFBT納米粒子的流體動力學直徑分布圖;(b)表面修飾的PFBT納米粒子的透射電鏡照片。Fig.2 (a)Hydrodynamic diameter of functionalized PFBT Pdotsmeasured by DLS.(b)TEM image of functionalized PFBT Pdots.

在另一研究中，Chiu等［46］發現Pdots的熒光性質與聚合物親水基團的含量有很大的依賴關系。他們合成了3種側鏈帶有不同數目羧基的PFBT Pdots(羧基的摩爾分數分別為50%，14%，2%)，研究發現羧基摩爾分數為50%的Pdots的熒光強度明顯弱于其他兩種Pdots。除了利用預共混的方式對Pdots進行表面功能化之外，還可以通過交聯的方式將功能性高分子共價連接到Pdots的表面［47］。值得注意的是，表面修飾的聚合物納米顆粒的單粒子熒光強度、內部結構、穩定性等特性會發生改變，因此需要嚴格控制Pdots的表面功能化過程［46］。近期，我們課題組采用再沉淀法制備了一種粒徑約為15 nm、表面帶有功能基團的含有銪配合物的納米粒子。這種納米粒子在水溶液中的膠體穩定性良好，克服了傳統包覆方法制備的納米粒子小分子滲漏的缺陷，并且在生物成像應用中，其熒光壽命遠遠比生物體的自體熒光壽命長，減少了背景熒光干擾，提高了信噪比［48］。

2.3 半導體聚合物量子點的基本特性

2.3.1 半導體聚合物量子點的粒徑和形貌

納米熒光探針的尺寸是其在生物應用中的一個重要考慮因素。納米探針的尺寸過大會導致位阻效應，這會減弱納米探針上靶向分子和生物分子相互作用的特異性，因此大多數生物成像實驗需要尺寸較小的多功能納米生物探針［49-50］。通常再沉淀法可以得到粒徑為5～30 nm的Pdots，這種尺寸的量子點可以很好地應用在生物實驗中［43］。在透射電子顯微鏡下，Pdots通常呈現出類似于球形的形貌，這可能是由于聚合物與水分子之間巨大的界面張力主導了其粒徑和形貌［51-52］。

本課題組研究發現，除了通過改變前驅體溶液的濃度來控制Pdots的粒徑之外，還可以通過在溶解聚合物的四氫呋喃溶劑中混入不同體積比(0%，30%，50%)的水來分別獲得不同尺寸(16，33，59 nm)的 Pdots［53］。圖3(a)、(b)、(c)分別是16，33，59 nm的Pdots單粒子熒光強度照片。

圖3(d)、(e)、(f)分別是相同實驗條件下相應尺寸的Pdots單粒子熒光強度直方圖，藍色曲線代表擬合曲線，得到它們強度的平均值為別為1 286，4 572，16 401，說明 Pdots的單粒子熒光隨著尺寸的增大而增強。實驗中還發現細胞對33 nm的Pdots攝取的最多，而16 nm的Pdots在免疫細胞標記實驗中的標記效率更高。這項研究對在生物成像應用中如何選擇合適尺寸的Pdots提供了指導。

圖3 粒徑分別為16 nm(a)、33 nm(b)、59 nm(c)的Pdots的單粒子熒光強度照片(標尺為5μm)，以及粒徑分別為16 nm(d)、33 nm(e)、59 nm(f)的Pdots的單粒子熒光強度直方圖。Fig.3 Single-particle fluorescence images of Pdot16(a)，Pdot33(b)，and Pdot59(c)，respectively.Scale bar represents 5 μm.Intensity histograms by analyzing single-particle brightness of hundreds of nanoparticles of Pdot 16(d)，Pdot 33(e)，and Pdot59(f)，respectively.

2.3.2 半導體聚合物量子點的光物理性質Pdots的光譜性質與聚合物分子構型密切相關。相對于聚合物分子在有機溶劑中的吸收光譜，再沉淀法得到的Pdots水溶液的吸收光譜有一定程度的展寬和藍移［43］，這與聚合物中高分子鏈在彎曲、扭轉的過程中引起的共軛骨架長度減少的現象相符合。圖4(a)和圖4(b)分別是幾種常見的Pdots的吸收光譜和熒光發射光譜。由圖4(a)可知，Pdots有比較寬的吸收帶，在350～600 nm的范圍內都有吸收。在一定波長范圍內，熒光納米粒子的光吸收能力可以由吸收截面來描述。當Pdots的濃度一定時，粒徑為15 nm的單粒子的吸收截面大約是10-13cm2。這個數值在可見光和近紫外區域內是CdSe Qdots吸收截面的十到幾百倍［54］。由圖4(b)可知，各種Pdots在可見光區域顯示出不同的發射峰。在大多數情況下，Pdots水溶液的發射光譜相對于有機溶劑中的聚合物的發射光譜表現出略微的紅移，這是由于聚合物分子鏈塌陷、鏈間的相互作用增加而產生了紅移聚集體［43］。這種紅移現象一般是在薄膜中被觀察到的［55］。

圖4(a)常見的Pdots的吸收光譜;(b)常見的Pdots的發射光譜;(c)單個PFBT納米粒子的光漂白軌跡曲線;(d)粒徑約為10 nm的單個PFBT納米粒子發射出光子數量的直方圖。Fig.4 (a)Absorption spectra of common Pdots.(b)Emission spectra of common Pdots.(c)Photobleaching trajectories of single PFBT nanoparticle.(d)Histogram of the photon numbers of individual PFBT Pdots of～10 nm diameter.

單個納米粒子的熒光亮度是由峰值吸收截面和熒光量子效率決定的。熒光量子效率定義為發射光子數目與吸收光子數目之比，它的值是評估熒光探針性能的標準之一。在早期的報道中，傳統的聚合物量子點的量子效率為1% ～20%［43］。而Chiu課題組［33］研究的一些新型π-共軛聚合物量子點的熒光量子效率可接近60%，這樣高熒光量子效率的Pdots可以與一些Qdots相媲美。由于Qdots通常具有較厚的殼層結構，一般摻雜染料的納米球由于自猝滅現象導致有效的熒光團濃度僅是顆粒體積或重量的百分之幾。相比之下，功能化的Pdots中的有效熒光基團濃度可達到80%以上［45］，可見Pdots是性能優異的熒光探針。

典型的熒光染料的熒光輻射速率常數約為108s-1，Pdots的熒光輻射速率常數的范圍在108～109s-1［56］。在單分子成像和粒子示蹤實驗中測得的染料分子熒光輻射速率值往往受三線態飽和的限制。由統計分析可知，Pdots的飽和輻射速率范圍在107～109s-1，這比典型的熒光染料的平均飽和輻射速率(約為106s-1)至少高出約100倍，比膠體半導體量子點的平均飽和輻射速率至少高出3個數量級［54］。擁有較快的熒光輻射速率的Pdots在流式細胞術和先進的動態成像實驗中有很大的應用優勢。

熒光染料或者納米粒子的光穩定性可以由光漂白量子產率(ΦB)描述。ΦB的值等于給定時間間隔內熒光染料或者納米粒子發生光漂白的分子數除以這段時間內吸收的光子總數。典型的熒光染料的 ΦB范圍一般在 10-4～10-6［57］。Pdots的ΦB值的范圍一般在 10-7～10-10［54］。單粒子的光漂白實驗結果可以評估Pdots的光穩定性。如圖4(c)所示，綠色曲線代表尺寸較大(＞10 nm)的PFBT Pdots的光漂白曲線，藍色曲線代表尺寸較小的PFBT Pdots的光漂白曲線。尺寸較大的PFBT Pdots具有較多的發色團，會出現連續的光漂白現象但卻無明顯的光閃爍;尺寸較小的PFBT Pdots通常表現出比較明顯的熒光閃爍。這表明PFBT的熒光閃爍依賴于納米粒子自身的尺寸［58-59］。如圖4(d)所示，粒徑約為10 nm的單個PFBT納米粒子的發射光子約為6×108個，比單個無機量子點的發射光子數(約107個)至少高出一個數量級［60］。

以往研究較多的兩種常用的熒光探針IgGAlexa 488和 Qdot 565的發射波長范圍與PFBT Pdots的發射波長范圍類似。PFBT Pdots、IgG-Alexa488和Qdot565的幾種光物理性質總結在表1中［45］。從表1可知，PFBT Pdots在488 nm 處的吸光系數遠高于IgG-Alexa 488和Qdot 565。在488 nm激發下，PFBT Pdots(尺寸約為10 nm)的熒光比相同實驗條件下的IgG-Alexa 488和Qdot 565強得多。

表1 PFBT Pdots，IgG-A lexa 488和Qdot 565的光物理特性Table 1 Photophysical properties of PFBT Pdots，IgG-Alexa 488 and Qdot565

2.3.3 半導體聚合物量子點的穩定性和生物毒性

一般來說，如果Pdots的水溶液不發生聚集，也不隨著時間的變化發生分解，以及與一些生物活性組分共存時保持良好的化學穩定性，我們就可以認為Pdots在生物實驗中是穩定的。我們將制備的Pdots水溶液在室溫下放置幾個月后，沒有發現明顯的聚集和沉淀，表明Pdots在水中表現了良好的膠體穩定性。然而，Pdots在含有高濃度多價金屬離子的溶液中傾向于聚集。研究結果已經表明［44-45］，表面修飾可以改善 Pdots的膠體穩定性。例如，在Pdots表面涂覆一層聚電解質可以使其在高離子強度體系中保持穩定［61］。另外，可鈍化 Pdots的添加劑(如牛血清白蛋白(BSA))可以使Pdots保持長期的膠體穩定性，同時降低Pdots在細胞標記實驗中的非特異性結合［45］。BSA鈍化的Pdots在 pH范圍為4～9的環境中可以保持6個月或更長時間的穩定性，同時在許多緩沖液中(HEPES、PBS、Tris以及硼酸鹽緩沖溶液等)也可以保持穩定。

生物相容性也是納米熒光探針在生物應用中的一個重要考慮因素。許多課題組已經對Pdots的毒性進行了研究，結果都表明Pdots具有非常低的細胞毒性。例如Christensen等［62］對尺寸約為18 nm的疏水性Pdots的細胞毒性進行了研究。他們在J774.A1細胞孵育的過程中加入了不同濃度的PFBT Pdots和Cell Titer Blue(追蹤細胞增殖活性的染料)。在細胞孵育18 h后，觀察到實驗組中加入不同濃度的Pdots的細胞的存活率與對照組中沒加Pdots的細胞的存活率相差很小;內吞了Pdots的細胞沒有損傷和裂解、形態正常，說明Pdots對細胞的增殖和活性沒有明顯的影響。

3 半導體聚合物量子點在生物學研究中的應用

3.1 細胞標記

具有小尺寸、高亮度、快速的輻射躍遷速率、良好的光穩定性以及無毒等優點的Pdots非常適合生物應用。體外細胞成像實驗中，基于細胞的內吞作用可以實現Pdots對細胞的非特異性標記［54］。Pdots和 Texas Red dextran的細胞內熒光共定位方法證明了細胞可以通過胞飲作用來攝取Pdots［62］。在特定波長激發下，共聚焦顯微鏡可以檢測到細胞內攝取的Pdots發出的強烈的熒光。由于Pdots具備高熒光亮度的特性，因此可以使用較低濃度的Pdots標記細胞，實驗中最低能檢測到155 pmol/L(270 ppb)的 Pdots，而且免疫熒光共定位的方法已經證實Pdots進入細胞后最終會到達溶酶體［62］。

在細胞特異性標記實驗中，Pdots與生物分子進行共價連接，通過抗原-抗體或者生物素-鏈霉親合素系統的相互作用再與細胞中的受體分子結合以實現細胞的特異性標記。免疫球蛋白G(IgG)和鏈霉親和素(Streptavidin)廣泛用于細胞靶向的免疫熒光標記。Chiu課題組［45］將表面功能化的Pdots分別與IgG和Streptavidin進行共價連接，制備了兩種粒徑為10～20 nm的Pdot-IgG和Pdot-streptavidin生物熒光探針并檢測了它們對細胞特異性標記的能力。上皮細胞粘附分子(EpCAM)是一種腫瘤標志物，常用來檢測循環腫瘤細胞。由圖5(a)可知，將人乳腺癌細胞(MCF-7)與anti-EpCAM抗體共同孵育一段時間后，使用Pdot-IgG標記可以檢測到MCF-7細胞表面發出Pdots的熒光，說明Pdot-IgG探針成功地標記了MCF-7細胞。由圖5(b)可知，使用Pdot-IgG標記未與anti-EpCAM抗體共同孵育的MCF-7細胞，共聚焦顯微鏡下沒有檢測到細胞表面發出Pdots的熒光。這兩個實驗結果說明Pdot-IgG探針可以對細胞實現高效率的特異性標記。此外，使用Pdot-streptavidin探針重復上述實驗也可以得到相似的實驗結果。使用流式細胞分析儀檢測特異性標記的細胞表面標記物，處理流式細胞數據得到圖5(c)和圖5(d)。圖5(c)是 Pdot-streptavidin標記細胞的熒光強度分布，圖5(d)是使用Qdot565與Streptavidin制備的Qdot-streptavidin探針在相同實驗條件下標記細胞的熒光強度分布。分析流式細胞儀數據可知，在標記細胞亮度方面，Pdot-streptavidin比Qdot-streptavidin的亮度高出約25倍，這個結果表明Pdots在細胞成像和生物測定等方面具有很大的應用潛力。

圖5 (a)Pdot-IgG標記與一級EpCAM單克隆抗體共同孵育一段時間后的MCF-7細胞的熒光圖片;(b)Pdot-IgG標記未與一級EpCAM單克隆抗體共同孵育的MCF-7細胞的熒光圖片;(c)Pdot-streptavidin標記細胞的熒光強度分布;(d)與Pdot-streptavidin標記細胞實驗相同條件下的Qdot-streptavidin標記細胞的熒光強度分布。Fig.5 (a)Fluorescence image of the cell-surfacemarker EpCAM on MCF-7 cells incubated sequentially with anti-EpCAM primary antibody and Pdot-IgG conjugates.(b)Fluorescence image of the control sample in which the cellswere incubated with Pdot-IgG alone(no primary EpCAM antibody).(c)Fluorescence intensity distributions for Pdot-streptavidin labeled MCF-7 cells.(d)Fluorescence intensity distributions for Qdot-streptavidin labeled MCF-7 cells obtained under identical experimental conditions as those used in(c).

在生物研究中，疊氮和炔基等基團不受生物體內各種反應的干擾和生物分子的影響，可以在復雜的生物體內和細胞環境中發生生物正交反應。表面帶有羧基的Pdots與含胺的小分子(如終端帶胺的聚乙二醇、炔胺分子、疊氮胺分子)連接可以獲得表面帶疊氮或炔基的Pdots，從而進行生物正交標記實驗［44］。圖6是Pdots的表面修飾和生物正交反應示意圖。實驗中使用含羧基的聚合物PSMA對Pdots進行表面修飾后，用一種碳二亞胺鹽酸鹽EDC催化表面功能化的Pdots與含胺的小分子之間的反應。隨后的實驗中使用Cu(Ⅰ)離子催化含疊氮基團的Pdots與終端含炔的蛋白質分子之間的生物正交反應。另一個實驗中，Chiu課題組［44］使用人工氨基酸(如 AHA或HPG)標記細胞中的蛋白質，實驗中可以觀測到這種被標記的蛋白質通過生物正交反應與偶聯了炔基的Pdots結合，從而實現高特異性的細胞靶向標記。

圖6 Pdots的表面修飾和生物正交反應示意圖Fig.6 Pdot functionalization and subsequent bioorthogonal labeling via click chemistry

3.2 體內成像

在光與生物體之間的相互作用中，散射、吸收和生物組織自體熒光等現象會嚴重干擾在體成像的熒光信號，所以生物體內熒光成像目前主要用于小動物實驗，并沒有廣泛地應用于臨床研究中。在體內成像實驗中使用亮度比傳統有機染料高幾個數量級的近紅外熒光探針可以達到更好的實驗效果。Pdots具有極強的吸光能力和高度靈敏的熒光信號，因此水溶性的Pdots在生物成像應用中具有顯著優勢［26，33］。Kim 研究組［63］已經成功地將半導體聚合物納米粒子應用于小鼠前哨淋巴結的體內成像實驗。

熒光探針的大小、表面性能和生物體的血腦屏障等因素都會影響活體成像技術在腦腫瘤組織研究中的實驗效果，因此腦腫瘤活體成像實驗是一項具有挑戰性的研究［64］。為此，Chiu課題組［65］開發了對深層組織滲透能力較強的尺寸約為10～20 nm的高亮度近紅外熒光Pdots，并選擇了對腫瘤親和性很強的蝎氯毒素Chlorotoxin(CTX)作為腫瘤靶向配體，最終得到了與腫瘤肽配體結合的生物熒光探針。由于ND2:SmoA1型小鼠的腦腫瘤與人類的髓母細胞瘤病理相似，因此ND2:SmoA1型小鼠是很好的研究模型。他們對ND2:SmoA1轉基因型(患病)和野生型(健康)兩種小鼠靜脈注射 Pdot-CTX和 Pdot-PEG(無CTX的對照組)兩種生物熒光探針。如圖7所示，對于注射Pdot-CTX的兩種類型的小鼠，24 h后可以觀測到野生型小鼠腦部無明顯的熒光，ND2:SmoA1型小鼠腦部長有腫瘤的區域發出Pdot-CTX的強烈的熒光信號。而注射Pdot-PEG的兩種類型的小鼠腦部區域均沒有明顯的熒光信號。這個實驗結果表明靶向熒光探針Pdot-CTX會與腫瘤細胞特異性結合并在腦部腫瘤區域累積。繼續觀察注射Pdot-CTX的兩種類型的小鼠，在靜脈注射72 h后，已觀測不到小鼠血液中有明顯的Pdot-CTX的熒光信號。對小鼠實行安樂死后取其腎臟、脾臟和肝臟，對各種器官內的熒光強度分布結果進行分析。結果顯示無論是野生型還是ND2:SmoA1型小鼠，腎臟內幾乎無熒光分布的，脾臟內的熒光信號強度較低，肝臟內熒光信號則很強，說明肝臟對Pdot-CTX探針有明顯的攝取，這暗示了小鼠體內的Pdot-CTX納米熒光探針可能是經由肝臟轉化為膽汁進而隨糞便排出體外［66］。該研究表明基于Pdots的熒光探針在體內癌癥臨床診斷和治療中具有巨大的應用潛力。

圖7 健康的野生型小鼠腦的熒光成像(左)和患有髓母細胞瘤的ND2:SmoA1小鼠腦的熒光成像(右)照片。分別經尾靜脈注射50μL濃度為1μmol/L非特異性的Pdot-PEG(上部)探針和特異性的Pdot-CTX(中部)探針的小鼠腦的熒光成像照片，對照組:沒有接受注射的小鼠腦的熒光成像照片(底部)。Fig.7 Fluorescence imaging of healthy brains in wild-type mice(left)and medulloblastoma tumors in ND2:SmoA1 mice(right).Each mouse was injected through the tail vein with 50μL of 1μmol/L solution of either non-targeting Pdot-PEG(top)，or targeting Pdot-CTX(middle).As a control，somemice did not receive injection(bottom).

3.3 生物傳感和單粒子示蹤

圖8 (a)摻雜PtOEP的PDHF納米顆粒的發射光譜，插圖是在氮氣飽和、空氣和氧氣飽和條件下紫外光照射得到的Pdots水溶液的照片;(b)Pdots的單粒子熒光示蹤照片。明場下一個固定的細胞的透射照片，藍色對應與膜結合的Pdots粒子，綠色對應細胞外的Pdots粒子，紅色對應細胞內部的Pdots粒子。Fig.8 (a)Emission spectra of the10%PtOEP-doped PDHF dots.The insetshows doped PDHF dots in aqueous solutions saturated with nitrogen，air and oxygen，respectively，under a UV lamp.(b)Single-particle fluorescence tracking with Pdots.Bright-field transmission image of a fixed cell.Blue corresponds to a particle bound to themembrane，green corresponds to a particle outside the cell，and red corresponds to the cell interior.

McNeill研究組［67］開發了具有內參比功能的熒光生物氧傳感器，在摻雜了對氧敏感的磷光染料分子PtOEP(Platinum(Ⅱ)octaethylporphine)的Pdots中，可以發生熒光共振能量轉移，從而檢測生物體中的氧濃度。圖8(a)是摻雜PtOEP的PDHF納米顆粒的發射光譜。在不同氧濃度下，在420 nm處的聚合物PDHF的發射峰幾乎不變，而在650 nm處的PtOEP的發射峰值則隨著氧氣濃度的減少而增大。圖8(a)插圖為在365 nm紫外燈照射下的照片:在氮氣飽和條件下，Pdots水溶液發射強烈的熒光;在空氣氣氛下，Pdots水溶液發射較弱的熒光;在氧氣飽和條件下，由于氧氣猝滅導致Pdots水溶液發射出微弱的熒光。近期，本課題組利用Tb3+與表面帶有羧基的Pdots反應形成螯合物，然后在螯合物溶液中加入一定濃度的細菌芽孢標記物CaDPA(Calcium dipicolinate)，最后得到了具有內參比功能的熒光傳感器，能夠檢測水溶液中的細菌芽孢［68］。

納米尺度的二維和三維的單粒子示蹤技術在細胞生命活動(馬達蛋白的運動、分子運輸、生物膜動力學等)的研究中有很多的應用［3，5］。McNeill等［69-70］研究了Pdots在納米尺度的二維和三維的粒子示蹤技術中的應用。他們使用倒置熒光顯微鏡CCD成像系統對單個納米顆粒進行圖像采集，分析了20個典型的單個納米顆粒的熒光強度軌跡，結果表明:單個聚合物納米顆粒發射的光子數平均約為109個，甚至可以超過1010個。這種檢測方法理論上可以達到1 nm的分辨率。圖8(b)是Pdots的單粒子熒光示蹤照片，Pdots可以與細胞的某些組分發生可逆或不可逆的結合，從而進行粒子追蹤，表明Pdots在檢測細胞中某些生物分子和亞細胞結構的遷移活動等研究中具有應用潛力。

3.4 藥物傳輸和光動力學療法

納米醫藥技術可以將藥物或者其他活性物質特異性地輸送到病患組織［71］。疏水的Pdots可作為輸送載體，利用載體的屏蔽作用可以保護藥物。藥物被包覆在Pdots內部或者與Pdots共價連接，在生物體內被輸送到患病組織處再被釋放出來［72］。目前納米醫藥的研究熱點之一是如何開發合適的Pdots使之用于藥物和基因傳遞。Wang等［73］將偶聯了抗癌藥物阿霉素(Doxorubicin)的聚谷氨酸包覆在聚合物PFO的內部，當到達病灶部位時，釋放出的阿霉素會猝滅PFO的熒光，所以可以通過監測PFO的熒光強度的變化來判斷釋放的藥物濃度的情況。

光動力學療法(Photodynamic therapy，PDT)是一種新型的癌癥臨床治療方法。在PDT當中，光敏劑可以和生物組織中的氧分子反應產生活性氧(ROS)，如對生物組織有毒的單線態氧(1O2)和氧自由基，從而殺死癌細胞。PDT可以在有限的區域內產生療效，并不會損壞病灶周圍的健康組織和細胞，所以在癌癥治療的臨床研究中已經成為一種重要的方法［74］。熒光共軛聚合物量子點自身可以作為光敏劑與生物體中的氧作用生成1O2。Wang等［75］制備了一種水溶性的含有卟啉的聚噻吩。在黑暗條件下，這種聚噻吩-卟啉復合聚合物對細胞沒有毒性;在光激發條件下，能量從聚噻吩骨架轉移到卟啉單元，從而誘導氧分子產生1O2，進而有效地殺死鄰近的癌細胞。

4 結 論

半導體聚合物納米粒子具有尺寸小、亮度高、輻射躍遷速率快、光穩定性和生物相容性好等優異特性。這種熒光探針在許多重要的領域，如熒光成像、生物傳感、藥物傳輸以及疾病診斷和治療等領域中有廣泛的應用。進一步優化半導體聚合物納米粒子的光學性能和表面特性，探索開發多功能的納米熒光探針可為今后的多模態醫學成像、疾病診斷和治療等領域的研究提供有意義的指導和幫助。

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張佳楠(1990-)，女，吉林長春人，碩士研究生，2013年于吉林大學獲得學士學位，主要從事納米生物熒光探針的研究。

E-mail:jianan13@mails.jlu.edu.cn

吳長鋒(1976-)，男，山東德州人，教授，博士生導師，2004年于長春光學精密機械與物理研究所獲得博士學位，2011年入選國家首批青年千人計劃，主要從事生物光子學、分子探針及成像技術、光電功能高分子材料、生物分析檢測與生物傳感器等方面的研究。

E-mail:cwu@jlu.edu.cn