巨噬細胞泡沫化對炎癥反應的影響*

宋 輝 楊 芳

巨噬細胞泡沫化對炎癥反應的影響*

宋 輝 楊 芳#

目的：觀察巨噬細胞泡沫化對促炎因子水平的影響。方法：取6-8周齡C57BL/6J雄性小鼠骨髓細胞，采用L929培養(yǎng)分化成巨噬細胞。在巨噬細胞懸液中加入不同濃度氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，分為空白對照組(0μg/ml)、10μg/ml組和25 μg/ml組，再培養(yǎng)24h后觀察各組細胞泡沫化程度，檢測分析各組泡沫細胞中促炎因子白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA的表達水平。結果：所取骨髓細胞被成功分化為巨噬細胞。不同濃度ox-LDL均能誘導巨噬細胞的泡沫化，25μg/ml組巨噬細胞泡沫化程度高于10μg/ml組(P<0.01)。與空白對照組相比，25μg/ml組的IL-1β和TNF-α mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。結論：巨噬細胞泡沫化可以抑制炎癥反應。

巨噬細胞；泡沫化；促炎因子；小鼠

冠心病是世界上死亡率最高的疾病之一，其主要病理機制是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)[1]。研究[2]證實，AS是一種炎癥反應，其特點為脂質(zhì)和膽固醇在大、中動脈血管內(nèi)膜的聚集。炎癥反應主要由動脈內(nèi)皮細胞激活和白細胞滲透引起[3]，細胞因子和化學因子在其中發(fā)揮了很大的作用[1]，當血液中富含載脂蛋白B(Apo-B)的脂蛋白濃度升高并在血管內(nèi)膜聚集時，內(nèi)皮細胞被激活并分泌多種細胞因子和化學因子，如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、轉(zhuǎn)錄生長因子-β(TGF-β)等，招募血液中的單核巨噬細胞和T細胞滲入到血管內(nèi)膜；T 細胞進入血管內(nèi)膜分化并分泌細胞因子提呈輔助性T細胞1(Th1) 和Th2，包括干擾素-γ(IFN-γ)、轉(zhuǎn)錄生長因子-α(TGF-α)、白介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)[4]。單核巨噬細胞分化成巨噬細胞并吞噬被修飾的低密度脂蛋白，即氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，最終形成巨噬細胞源性泡沫細胞[5，6]。在巨噬細胞內(nèi)，被吞噬的ox-LDL合成膽固醇脂并聚集為脂滴，形成泡沫細胞，巨噬細胞的泡沫化一直被認為是一個促炎反應過程[7]。雖然對AS與炎癥反應的研究較多，但是巨噬細胞泡沫化過程中炎性細胞相互作用如何引起炎癥反應仍是目前探討的熱點。本實驗觀察巨噬細胞泡沫化對炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

C57BL/6J雄性小鼠(6-8周齡，體重22-25g)購自武漢大學動物實驗中心，取其骨髓細胞用于巨噬細胞的分化。15% L929 培養(yǎng)液為15% 培養(yǎng)小鼠成纖維細胞系所得的上清液(含有M-CSF類似物)與85% IMDM液體培養(yǎng)基的混合物，IMDM液體培養(yǎng)基(貨號：SH30228.01B)購自Hyclone公司，ox-LDL購自美國Biomedical Technologies公司，乙二胺四乙酸(EDTA)粉 (貨號：E6758)、油紅染料粉(貨號：O9755)、10% 福爾馬林溶液(貨號：F8775)、TRIzol溶液(貨號：T9424)均購自美國Sigma公司，熒光抗體CD11b(貨號：12-0112-41)、F4/80(貨號：12-0113-41)購自美國eBioscience公司。60%異丙醇(貨號：IT7048)購自上海生工公司。細胞濾網(wǎng)(貨號：352350)購自中國Corning公司，牛巴氏計數(shù)板(貨號：717805)購自廣州華奧瑞公司，C6流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司，Bio-Rad CFX384熒光定量檢測儀、q-PCR試劑盒(貨號：1725140)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓細胞的獲取及計數(shù)：頸椎脫臼法處死實驗小鼠后抽取骨髓細胞。用 70μm孔徑的細胞濾網(wǎng)過濾后加2倍體積紅細胞裂解液冰上裂解10min，400g離心5min取沉淀。用10ml含15% L929培養(yǎng)液重懸細胞。吸取細胞懸液10μl，滴滿牛巴氏計數(shù)板，10×10倍光鏡下計數(shù)骨髓細胞數(shù)/ml[=(四大格內(nèi)細胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)]。

1.2.2 骨髓細胞培養(yǎng)及巨噬細胞鑒定:將上述骨髓細胞用15% L929培養(yǎng)液制成2×106/ml懸液，加入12孔板中(每孔1 ml)。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。6天后，用EDTA消化細胞，400g離心5min，PBS重懸后加入熒光抗體CD11b-PE和F4/80-FITC，常溫暗室孵育10min。400g離心5min，取沉淀用100μl PBS重懸。上流式細胞儀檢測培養(yǎng)細胞膜上標志蛋白CD11b、F4/80的表達(CD11b和F4/80雙陽性為巨噬細胞)。本次培養(yǎng)骨髓細胞成功分化為巨噬細胞，其純度為98.1%，見圖1。

圖1 骨髓細胞培養(yǎng)分化為巨噬細胞的流式細胞圖

1.2.3 實驗分組與處理:將成功分化的巨噬細胞用100%的IMDM培養(yǎng)液制成2×106/ml細胞懸液，加入不同濃度ox-LDL分成3組，包括空白對照組(0μg/ml)、10μg/ml組和25μg/ml組，混勻后加入12孔板，每組6個復孔，于37℃、5% CO2中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.4 觀察巨噬細胞泡沫化：取出12孔板，PBS洗2次后10%福爾馬林固定30min，再用PBS洗2次后加入60%異丙醇，室溫放置5min。每孔加入500μl油紅染料(將30mg油紅粉末溶于10ml異丙醇中制成)，室溫放置10min后，用去離子水洗2次，10×25倍光鏡下觀察，泡沫化巨噬細胞內(nèi)聚集的脂滴經(jīng)油紅染料染成紅色。隨機選取10個視野，計數(shù)紅染細胞，并計算百分率。

1.2.5 IL-1β和TNF-α mRNA檢測：取出12孔板，PBS洗2次后，每孔加入500μl TRIzol裂解液，按常規(guī)方法提取細胞總RNA并測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

各種引物序列見表1。實時熒光定量PCR：反應體系共10μl，反應條件：94 ℃ 5min預變性，95 ℃ 45s，60 ℃ 1min，40個循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參照同時設置空白對照。以PCR反應前3-15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)即為Ct值。以ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量，ΔΔCt=2-(Ct目的基因-Ctβ-actin)，每組重復3次取平均值。

表1 各基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組巨噬細胞泡沫化程度

圖2顯示空白對照組紅染巨噬細胞(即泡沫化巨噬細胞)較少，隨著ox-LDL濃度增加，紅染巨噬細胞增多，25μg/ml組明顯多于10μg/ml組。定量分析表明三組間紅染細胞百分率差異有統(tǒng)計學意義(F=1190,P<0.01)。與空白對照組(2.04%±0.17%)相比，10μg/ml組(13.34%±0.48%)和25μg/ml組(31.62%±0.55%)巨噬細胞泡沫化程度均顯著增加(t=22.03和t=51.65，P均<0.01)，且25μg/ml組巨噬細胞泡沫化程度又明顯高于10μg/ml組(t=25.06，P<0.01)。

2.2 各組促炎因子水平

各組IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。IL-1β mRNA水平，10μg/ml組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；25μg/ml組較空白對照組和10μg/ml組顯著降低(t值分別為3.58和3.60，均P<0.05)。TNF-α mRNA水平，與空白對照組比較，10μg/ml組顯著下降(t=5.27，P<0.01)；25μg/ml組TNF-α mRNA表達水平雖較10μg/ml組有所升高，但仍低于空白對照組(t=3.67，P<0.05)。見表2。

[本文圖2見插1反面]

3 討 論

泡沫細胞是AS斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細胞，可視為AS形成的標志。脂質(zhì)斑塊內(nèi)，由于分泌Th2細胞因子的免疫細胞相對較少，AS的炎癥反應是以Th1驅(qū)動為主的促炎反應[8]。在AS血管內(nèi)膜，隨著LDL的聚集，一些先天性和后天性免疫細胞滲透到血管內(nèi)膜下，分泌一些細胞因子如IFN-γ、TGF-α，加速泡沫細胞的形成[9]。有研究[10，11]顯示，巨噬細胞低效清除ox-LDL能促進自身和其它免疫細胞分泌促炎因子和化學因子，使更多免疫細胞被招募到內(nèi)膜，加速炎癥反應進程。但也有研究[12]顯示，體內(nèi)巨噬細胞源性泡沫細胞中促炎因子水平下調(diào)。Spann等[13]曾報道，巨噬細胞源性泡沫細胞可通過上調(diào)肝X受體(LXR)激活抗炎反應。

表2 各組細胞IL-1β和TNF-α mRNA水平比較均=3)

注：與空白對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與10μg/ml組比較，3)P<0.05

本文通過體外實驗檢測分析了ox-LDL對巨噬細胞泡沫化的影響。結果表明，10μg/ml和25μg/ml ox-LDL均能使巨噬細胞泡沫化，油紅染色結果顯示巨噬細胞內(nèi)有大量的脂滴聚集。且以25μg/ml組泡沫化程度更高，提示較高水平ox-LDL更利于巨噬細胞泡沫化。另外，本文進一步檢測了巨噬細胞源性泡沫細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α mRNA表達水平。結果顯示，與空白對照組比較，IL-1β mRNA的表達水平僅在25μg/ml組顯著降低，TNF-α在10μg/ml組和25μg/ml組的表達水平均顯著下降，表明泡沫細胞在10μg/ml ox-LDL處理時主要通過下調(diào)TNF-α來調(diào)節(jié)炎癥反應進程，在25μg/ml ox-LDL處理時可同時通過下調(diào)IL-1β和TNF-α來影響炎癥反應的進程。其具體機制有待繼續(xù)深入研究。

綜上所述，巨噬細胞源性泡沫細胞能顯著降低促炎因子分泌，繼而影響AS進程，為AS的治療提供了依據(jù)。

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本文第一作者簡介：

宋 輝(1987-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為心血管疾病發(fā)生機制參考文獻

1 McLaren JE, Michael DR, Ashlin TG, et al. Cytokines, macrophage lipid metabolism and foam cells: implications for cardiovascular disease therapy[J]. Prog Lipid Res, 2011, 50(4): 331-347.

2 Lusis AJ. Atherosclerosis[J]. Nature, 2000, 407(3): 233-241.

3 Zhang PY, Xu X, Li XC. Cardiovascular diseases: oxidative damage and antioxidant protection[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(20): 3 091-3 096.

4 Singh NN, Ramji DP. The role of transforming growth factor-beta in atherosclerosis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2006 17(6): 487-499.

5 Paoli FD, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. Macrophage phenotypes and their modulation in atherosclerosis[J]. Circ J, 2014, 78(1): 1 775-1 781.

6 Moore KJ, Tabas I. Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis[J]. Cell, 2011, 145(3): 341-355.

7 Charo IF, Taubman MB. Chemokines in the pathogenesis of vascular disease[J]. Circ Res, 2004, 95(9): 858-866.

8 Hansson GK, Libby P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword[J]. Nat Rev Immunol, 2006, 6(7): 508-519.

9 McLaren JE, Ramji DP. Interferon gamma: a master regulator of atherosclerosis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2009, 20(2): 125-135.

10 Babaev VR, Chew JD, Ding L, et al. Macrophage EP4 deficiency increases apoptosis and suppresses early atherosclerosis[J]. Cell Metab, 2008, 8(6): 492-501.

11 Hamada M, Nakamura M, Tran MT, et al. MafB promotes atherosclerosis by inhibiting foam-cell apoptosis[J]. Nat Commun, 2014, 5(3): 3 147.

12 Lee WR, Kim KH. Regulation of an inflammatory disease: Kr ppel-like factors and atherosclerosis[J]. Basic Clin Phamacol Toxicol, 2013, 112(4): 236-243.

13 Spann NJ, Garmire LX, McDonald JG, et al. Regulated accumulation of desmosterol integrates macrophage lipid metabolism and inflammatory responses[J]. Cell, 2012, 151(1): 138-152.

Effect of Macrophage Derived Foam Cell on Inflammatory Responses

SONG Hui, YANG Fang#

Department of Physiology, Basic Medical School, Wuhan University, Wuhan 430079, China;#

Objective: To investigate the effect of macrophage derived foam cell on inflammatory responses.Method: Bone marrow cells from 6-8 weeks’ male C57BL/6J mice were treated with L929 for macrophage differentiation for 6 days. Then macrophage was treated with different concentration of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)，divided into 3 groups: control group(0μg/ml),10μg/ml group and 25μg/ml group. The macrophage derived foam cells were stained by oil red O and the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α were measured by Real-time PCR.Results: The monocytes of bone marrow cells differentiated to macrophages successfully. Different concentration of oxLDL induced the foam cell formation and the effect of 25μg/ml group was greater than 10μg/ml group (P<0.01). Comparing to the control group, the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α was significantly decreased in 25μg/ml group (P<0.05).Conclusion: Macrophage derived foam cells have inhibitional effect on inflammatory responses.

Macrophage; Foam cell; Pro-inflammatory cytokines; Mice

國家自然科學基金(31170328, 30900122)

武漢大學基礎醫(yī)學院生理學系，武漢 430079；#

，E-mail：fang-yang@whu.edu.cn

本文2014-12-08收到，2015-01-13修回

R543.1

A

1005-1740(2015)02-0019-04