糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠氧化應激及細胞凋亡的影響

易文明 孫文 郭翔宇 呂翠巖 劉銅華

糖尿病性周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病經常出現的慢性并發癥之一，它很容易造成糖尿病足及截肢，有癥狀的發病率波動在50% ～70%，甚至更高，由于診斷方法不統一，有的報道發病率可高達90%以上［1-2］，基于DPN非常高的發病率和致殘率，DPN的預防和治療已經成為學科內研究的重點領域。目前西藥治療DPN尚缺乏有效手段，而中醫藥治療DPN積累了豐富經驗，療效確切，但作用機制亟待闡明。中藥復方糖痹康經過了多年的臨床應用，療效較好，目前已獲發明專利(專利申請號:200810167551.1)。本實驗研究是在既往研究的基礎上，選用SPF級SD大鼠，通過高脂飼料喂養后，采用小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘發2型糖尿病，構建DPN動物模型［3］，緊緊圍繞DPN核心發病機制——氧化應激與細胞凋亡，觀察與其密切相關的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、Caspase-3蛋白酶等與 DPN的關系，探討糖痹康治療DPN的作用機理，為臨床推廣應用提供理論依據，為以改善神經病變為目的的新藥研發探索新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只純系SPF級SD雄性大鼠，體質量(180±20)g，7周齡，從北京維通利華動物實驗中心購買，生產許可證:SCXR(京)2004-0006。

1.2 材料及儀器

糖痹康(黃芪30 g、女貞子15 g、桂枝10 g、赤芍10 g、黃芩 10 g、黃連 10 g、水蛭 6 g，由北京中醫藥大學中藥學院提供);α-硫辛酸購自Puritan’s Pride公司(100 mg×60粒，生產批號:250597-09 EXP 10/17);高脂飼料，購自北京華阜康生物科技有限公司;羅氏活力型血糖儀(購自美國羅氏公司，型號:ACCU-CHEK);丙二醛(MDA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);活性氧簇(ROS)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);VC-10(日本光電)記憶示波器，PowerLab多功能生理信號采樣分析系統，SEN-3201電刺激器(購自日本光電);TUNEL試劑盒(購自美國Upstate公司);大鼠Caspase-3試劑盒(購自美國GBD公司);熒光顯微鏡(購自德國Zeiss公司)等。

1.3 模型建立及分組

大鼠常規飼養1周后，按體質量隨機選擇10只為正常組，采用普通飼料飼養，其它組大鼠采用高脂飼料喂養，8周后，禁食12小時后準備造模，造模藥物鏈脲霉素用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.4)配成1%的濃度，劑量以35 mg/kg進行腹腔注射，72小時后檢測大鼠血糖值(尾部血管取血)，血糖≥16.7 mmol/L以上者視為造模成功，按大鼠體重隨機分為模型組，α-硫辛酸組，糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

1.4 給藥方法

模型復制成功3天后開始大鼠灌胃，劑量為糖痹康低劑量組4.175g/(kg·d)，糖痹康中劑量組8.35 g/(kg·d)，糖痹康高劑量組 16.7 g/(kg·d)，α-硫辛酸組灌服 α-硫辛酸20 mg/(kg·d)，每天1次，連續給藥16周。實驗期間各組大鼠均自由取食、飲水。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 體重、血糖檢測 灌胃前和灌胃后的第4、8、12、16周末，禁食6小時，大鼠稱重及檢測血糖。1.5.2 神經電生理 檢測大鼠右側坐骨神經運動神經傳導速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。大鼠麻醉后，以俯臥位固定好，開始將刺激針電極放置在跺關節內側面，其次放置在坐骨切跡處，波寬為0.1 ms，強度為超強刺激，用針電極記錄，保持每2個刺激之間的間隔時間在5 s以上，反復測定7～10次，算出平均值。掃描速度保持在2 ms/cm，記錄頻率3～10000 Hz，放大倍數2 mv/cm。使大鼠后肢以自然狀態與后背脊柱成45°夾角，然后向斜后方拉直，順著坐骨神經方向，測出大鼠體表兩個刺激點之間的長度，從而計算出MNCV。

1.5.3 黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量 第16周末，用10%水合氯醛以0.4 mg/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠固定于鼠板上，先切開雙側后腿中外1/3處皮膚，接著鈍性分離出肌肉組織，將坐骨神經充分暴露，旁邊肌肉去除，取出盡可能長的坐骨神經，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，天平稱其質量后放入凍存管內，于冰壺內冷凍，最后放入－80℃冰箱保存。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量(按照試劑盒提供的操作流程進行)。

1.5.4 硫代巴比妥酸法測MDA含量 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進行。

1.5.5 比色法檢測ROS含量 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進行。

1.5.6 酶聯免疫吸附法測定坐骨神經caspas-3蛋白表達水平 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進行。

1.5.7 TUNEL法測定細胞凋亡 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進行。

1.6 統計學分析

各組數據用SPSS 19.0統計軟件分析進行數據處理，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，本實驗數據方差齊，兩兩比較用LSD-t檢驗分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

造模72小時后，大鼠表現出多食多尿，體質量下降，精神萎靡，體毛色澤干枯，活動變得遲緩，在14周后還出現了身體潰瘍等情況，而在α-硫辛酸組和中藥糖痹康高劑量組以上情況出現的較少。

2.2 體質量稱量

和正常組相比，從8周開始，模型組大鼠的體質量較前輕度下降(P＜0.05);在16周后，模型組大鼠體質量明顯下降(P＜0.01)。和模型組比較，16周后，糖痹康低、中劑量及α-硫辛酸組體質量明顯增加(P＜0.01)。見表1。

表1 不同時間點各組DPN大鼠體質量的比較(g，n=10，±s

表1 不同時間點各組DPN大鼠體質量的比較(g，n=10，±s

注:與正常組比較，aP ＜0.05，cP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.01

組別 干預前干預后4周 8周 12周 16周正 常 組 409.11 ±16.10 429.48 ±33.45 459.67 ±57.32 481.22 ±64.84 446.59 ±78.76.13 ±17.66 512.34 ±9.98模 型 組 434.20 ±15.19 423.32 ±14.67 412.69 ±31.46a 406.12 ±35.34a 349.34 ±23.39c α-硫辛酸組 425.07 ±49.69 427.79 ±31.94 427.13 ±35.66 433.24 ±28.68 464.57 ±29.67ab糖痹康低 426.03 ±19.03 437.12 ±20.99 447.38 ±35.87 456.33 ±37.74 481.76 ±35.95b糖痹康中 415.97 ±45.06 422.62 ±46.97 441.35 ±58.67 449.37 ±69.31 483.45 ±31.37b糖痹康高 408.91 ±55.96 426.38 ±62.24 428.16 ±62.93 443

表2 不同時間點各組DPN大鼠血糖的比較(mmol/L，n=10，±s)

表2 不同時間點各組DPN大鼠血糖的比較(mmol/L，n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01

組別 干預前干預后4周 8周 12周 16周39 ±0.41模型組 20.13 ±1.57a 21.09 ±1.61a 21.01 ±1.58a 22.34 ±0.98a 22.97 ±0.79a α-硫辛酸組 20.99 ±1.78a 20.78 ±1.72a 18.74 ±2.15a 19.92 ±1.98a 20.84 ±1.74ab糖痹康低 22.85 ±1.51a 20.47 ±0.86a 19.46 ±2.29a 19.43 ±2.07a 18.97 ±2.17ac糖痹康中 20.99 ±1.88a 18.36 ±2.13ac 15.67 ±1.74ab 15.87 ±1.74ab 14.69 ±1.67ac糖痹康高 21.27 ±1.14a 18.65 ±1.19ac 11.78 ±1.82ab 9.98 ±2.18ac 9.24 ±2.19正常組 5.68 ±0.52 5.82 ±0.79 5.99 ±0.29 6.17 ±0.64 6.ac

表3 各組DPN大鼠坐骨神經傳導速度比較(m/s，n=10，±s)

表3 各組DPN大鼠坐骨神經傳導速度比較(m/s，n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 4周 8周 12周 16周08模型組 15.09 ±1.08a 13.99 ±1.31a 14.08 ±0.97a 13.14 ±1.35a α-硫辛酸組 15.42 ±1.51b 16.75 ±1.43b 16.65 ±1.21b 16.94 ±1.21b糖痹康低 15.23 ±1.23b 15.09 ±1.07b 15.67 ±1.74b 15.89 ±1.48b糖痹康中 16.47 ±1.24b 17.09 ±1.65b 17.88 ±1.91b 18.49 ±1.52b糖痹康高 16.91 ±1.87b 19.72 ±1.27b 19.46 ±1.76b 20.56 ±1.53正常組 19.98 ±1.41 20.32 ±1.04 21.09 ±0.99 20.88 ±1.b

2.3 血糖檢測

和正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高(P＜0.01);和模型組比較，干預以后各組大鼠血糖較前都有所改善，其中α-硫辛酸組(P＜0.05)和糖痹康低劑量組(P＜0.01)在16周后有明顯差異，而糖痹康中、高劑量組在4、8、12、16周都有明顯下降(P ＜0.01)。見表2。

2.4 右側坐骨神經運動神經傳導速度測定

和正常組比較，模型組大鼠坐骨神經傳導速度顯著減慢;和模型組比較，糖痹康各劑量組及α-硫辛酸組都能提高糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度(P＜0.05)，組間比較，糖痹康高劑量組的效果優于α-硫辛酸組(P＜0.05)，糖痹康各劑量組間相對比，高劑量組改善效果更加顯著(P＜0.05)，提示糖痹康能夠提高糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度。見表3。

2.5 各組大鼠坐骨神經組織 ROS、MDA、SOD含量測定

與正常組比較，各組大鼠坐骨神經ROS、MDA含量顯著升高，而SOD含量顯著降低(P＜0.01)，說明糖尿病周圍神經病變大鼠存在氧化應激狀態，與模型組比較，α-硫辛酸組和糖痹康中、高劑量組ROS、MDA含量明顯著減少，SOD含量顯著增加(P＜0.05)，α-硫辛酸組和糖痹康高劑量組相比，ROS、MDA、SOD含量無明顯差異，提示糖痹康可能具有抗氧化應激的作用。見表4。

表4 各組DPN大鼠ROS、SOD、MDA濃度(n=10，±s)

表4 各組DPN大鼠ROS、SOD、MDA濃度(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 ROS(U/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot 160.74 ±17.97 65.89 ±8.63 3.91 ±0.48模型組 221.31 ±22.08a 44.34 ±6.74a 8.67 ±129a α-硫辛酸組 167.65 ±16.76b 59.61 ±7.12b 4.45 ±0.37b糖痹康低 219.98 ±17.43 43.74 ±5.76 8.36 ±0.53糖痹康中 193.76 ±19.32b 52.67 ±4.58b 5.82 ±0.33b糖痹康高 175.87 ±18.92b 58.99 ±5.46b 5.01 ±0.62)正常組b

2.6 TUNEL法檢測神經細胞凋亡

正常組坐骨神經組織TUNEL檢測沒有找到陽性細胞，表明正常組坐骨神經神經元未發生凋亡。與模型組相比，α-硫辛酸組和糖痹康高劑量組發現的陽性細胞數減少(P＜0.05);糖痹康高劑量組與α-硫辛酸組比較，發現的陽性細胞數略高于α-硫辛酸組(P＜0.05)，提示糖痹康具有抗神經元凋亡的作用。見表5。

表5 各組DPN大鼠坐骨神經神經元TUNEL陽性細胞數(n=10，±s)

表5 各組DPN大鼠坐骨神經神經元TUNEL陽性細胞數(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.05;與西藥組比較，cP ＜0.05

組別 神經元凋亡數目正常組0模型組 9.39 ±1.12a α-硫辛酸組 5.85 ±2.16ab糖痹康低 9.51 ±1.03糖痹康中 8.92 ±1.91糖痹康高 6.55 ±1.89abc

2.7 Caspase-3蛋白表達水平測定

模型組、α-硫辛酸組和糖痹康組坐骨神經組織Caspase-3蛋白明顯高于正常組(P＜0.05);α-硫辛酸組、糖痹康高劑量組大鼠坐骨神經組織Caspase-3蛋白表達顯著低于模型組(P＜0.05)，兩組間Caspase-3蛋白表達的差異無統計學意義。提示糖痹康可抑制Caspase-3蛋白的表達，具有抗凋亡的作用。見表6。

表6 各組DPN大鼠坐骨神經Caspase-3蛋白表達水平比較(n=10，±s)

表6 各組DPN大鼠坐骨神經Caspase-3蛋白表達水平比較(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 Caspase-3(ng/ml)23.18 ±4.57模型組 57.82 ±15.21a α-硫辛酸組 46.24 ±13.72ab糖痹康低 55.56 ±15.26糖痹康中 54.89 ±15.19糖痹康高 44.32 ±8.99正常組ab

3 討論

DPN的發病機制目前還不是十分清楚，不能用單一因素來解釋，而應該是多種因素相互作用的結果。其可能發病機制主要包括代謝原因和血管原因，還有多元醇途徑、晚期糖基化終末產物(advanced glycation endproducts，AGEs)途徑、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑、氨基已糖途徑、生長因子缺乏、氧化應激、神經營養因子、免疫因素等等。很多研究提示氧化應激在DPN的眾多發病機制中占有重要的地位，可能是糖尿病并發癥產生的一個核心通路。大鼠鏈脲佐菌素DM模型的動物實驗證明，糖尿病或高血糖狀態下可引起背根神經節中 O2－、H2O2及過氧化物增多［4］，Brownlee 提出高血糖時體內氧化應激增強，造成線粒體中超氧陰離子產生過多，最終引起包括糖尿病周圍神經病變等一系列的慢性并發癥［5］。生理情況下，ROS在人體內的代謝很穩定，如果在病理狀態下產生了過量的ROS導致人體抗氧化系統不能清除過多的ROS時，就會啟動氧化應激反應，造成機體損傷［6］，SOD是人體一種重要的酶，它是自由基的清道夫，它能夠將O2－轉化為H2O2或者O2，通過對SOD含量進行測定，可以初步評價高血糖狀態下組織抗氧化能力。MDA是一種自由基影響下多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產物，它的含量可以提示機體脂肪過氧化速率和強度及體內的自由基代謝情況，也能夠推斷機體氧化應激受損程度。Caspase家族被發現與細胞凋亡密切相關，Caspase-3為Caspase家族中的凋亡執行因子，被認為是細胞凋亡過程中的關鍵酶之一［7-8］，Caspase-3 可直接導致細胞凋亡［9］。課題組認為氧化應激引起的細胞凋亡在促進DPN的進展。

課題組前期細胞及動物實驗［10-11］證明，糖痹康有緩解氧化應激的作用，阻止和延緩了DPN的病變發展進程，本研究進一步證實糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠的氧化應激和細胞凋亡具有對抗作用，糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經中SOD的含量顯著下降而MAD、ROS含量明顯增高，Caspase-3蛋白表達增加，氧化應激啟動后細胞凋亡明顯增加，而糖痹康可顯著上調糖尿病周圍神經病變大鼠SOD水平和下調MAD、ROS水平，可抑制Caspase-3蛋白的表達，具有抗氧化應激和細胞凋亡的作用。因此筆者認為，糖痹康具有的抗氧化應激及細胞凋亡能力可能是其對糖尿病性周圍神經病變的神經保護作用的主要機制之一。

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(本文編輯:韓虹娟)