大鼠卵巢組織冷凍復蘇及自體異位移植研究

李冬秀，耿楊柳，吳小華，于曉惠，張　敏，徐清華

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大鼠卵巢組織冷凍復蘇及自體異位移植研究

李冬秀，耿楊柳，吳小華，于曉惠，張敏，徐清華

[摘要]目的探討直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification， DCV)在冷凍大鼠卵巢組織中的效果，并對自體異位移植后卵巢組織存活狀況及內(nèi)分泌情況進行分析。方法性成熟的Wistar大鼠50只隨機分為A、B、C、D組，A和B組各20只，C和D組各5只。A組為新鮮卵巢組織移植；B組卵巢組織經(jīng)DCV冷凍保存2周復蘇后移植；C組為去勢對照；D組為假手術(shù)對照。自體異位移植6周后檢測大鼠血清中雌二醇(E2)水平，計算卵泡密度，觀察移植卵巢組織形態(tài)學及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達情況。結(jié)果大鼠卵巢組織移植存活的卵巢組織周圍可見血管供應(yīng)，移植失敗的卵巢組織呈纖維化狀態(tài)，與周圍組織血供不明顯。B組卵巢組織移植存活率低于A組(P<0.05)。B組卵巢組織中卵泡密度均低于A、D組，且A組低于D組(P<0.05)。A、B組血清E2水平高于C組，低于D組(P<0.05)。A、B組卵巢組織PCNA陽性率均低于D組，且B組低于A組(P<0.05)。結(jié)論大鼠卵巢組織經(jīng)DCV法凍融自體異位移植后部分卵泡能存活并可恢復內(nèi)分泌功能。

[關(guān)鍵詞]卵巢；玻璃化作用；低溫保存；移植物存活；移植,自體；大鼠,Wistar

近年，女性惡性腫瘤發(fā)病率逐年升高且漸趨年輕化。美國一項數(shù)據(jù)調(diào)查顯示<40歲女性惡性腫瘤發(fā)病率為10%。隨著腫瘤綜合治療技術(shù)的進步，女性腫瘤患者的生存率得到大幅提高，但是大劑量放化療導致的卵巢早衰、生育能力喪失及女性內(nèi)分泌失調(diào)等問題亟待解決[1-2]。如何在惡性腫瘤得到治療后繼續(xù)保持女性原有內(nèi)分泌及生育功能是腫瘤學和生殖內(nèi)分泌學領(lǐng)域關(guān)注的熱點。目前，保存女性生育能力最常用的方法為胚胎冷凍、卵母細胞冷凍及卵巢組織冷凍。胚胎冷凍技術(shù)已是穩(wěn)定成熟的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于人類輔助生殖，但是只適合于有配偶的女性，而且還需長時間促排卵治療，對于有些腫瘤患者如雌激素依賴性腫瘤是不適合的[3]。卵巢組織冷凍不需要藥物誘發(fā)排卵，因此不會耽誤原有腫瘤的治療。卵巢組織皮質(zhì)中保存有大量的竇卵泡，如果能將卵巢組織進行冷凍復蘇，保存其中的竇卵泡，再移植到自體、異體或直接將卵巢組織進行體外培養(yǎng)，有望保存患者的生育能力，并且有助于恢復女性內(nèi)分泌功能，有效提高患者生活質(zhì)量。本研究建立了大鼠卵巢組織自體移植模型，觀察新鮮卵巢組織和經(jīng)直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification， DCV)復蘇后的卵巢組織異位移植后的生長情況，旨在為凍融人類卵巢組織探索合理的方案。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組成熟雌性Wistar大鼠50只(購自河北醫(yī)科大學動物研究中心)，8～10周齡，體重200～220 g。將大鼠隨機分為A、B、C、D組，A、B組各20只，C、D組各5只。A組(新鮮移植組)：手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢組織后將皮質(zhì)進行自體異位移植；B組(DCV組)：手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢組織，將卵巢組織取材冷凍保存2周后，解凍卵巢組織，進行自體異位移植；C組(去勢對照組)：只切除雙側(cè)卵巢組織，不進行卵巢移植，旨在觀察卵巢切除是否徹底；D組(假手術(shù)組)：對大鼠進行開關(guān)腹手術(shù)，不對卵巢進行操作。本研究經(jīng)解放軍白求恩國際和平醫(yī)院倫理委員會批準,于該院動物實驗中心進行，該中心達到SPF條件。對動物處置符合科學技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

1.2標本采集給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒、開腹，手術(shù)切除雙側(cè)完整卵巢。用生理鹽水反復沖洗卵巢組織至少3遍，將卵巢皮質(zhì)切成2 mm×2 mm×4 mm的小塊，用于后續(xù)研究。術(shù)后對大鼠手術(shù)切口進行聚維酮碘消毒，肌內(nèi)注射青霉素，2/d，連續(xù)用藥7 d。

1.3DCVDCV過程參考Chen等[4]方法，所有操作均在室溫下進行，將卵巢組織塊浸入平衡液[7.5%乙二醇(v/v)+7.5%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，滲透平衡15 min，再移入冷凍液[15%乙二醇(v/v)+15%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，滲透平衡5 min。輕柔夾取卵巢組織皮質(zhì)，置于1.8 ml無菌冷凍管中，將冷凍管用清潔液氮充滿密封，投入貯存液氮罐中備用。

1.4復蘇冷凍2周后從液氮罐中取出冷凍管，37℃水浴中解凍30 s，將卵巢組織塊依次移入含0.5、0.25、0.125 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液的解凍液中，每個濃度各停留5 min，再用含20%胎牛血清的DMEM沖洗2次。

1.5自體異位移植A、B組于大鼠左側(cè)后肢做一長0.8 cm縱切口，將新鮮或凍融卵巢組織塊移植于肌肉中，常規(guī)縫合，術(shù)后對手術(shù)切口進行聚維酮碘消毒，肌內(nèi)注射青霉素，2/d，連續(xù)用藥7 d。

1.6移植后大鼠情況及移植物的取出卵巢組織移植6周后，開始每日行陰道涂片，顯微鏡下觀察脫落細胞類型，出現(xiàn)動情周期的大鼠依據(jù)陰道上皮類型進行判定，未出現(xiàn)動情周期的大鼠觀察角化細胞，角化細胞比例>50%則認為有雌激素樣效應(yīng)。斷頭法處死大鼠，取血測定血清雌二醇(E2)水平，手術(shù)剝除移植物。

1.7觀察指標及檢測方法

1.7.1E2水平測定：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清中的E2水平。

1.7.2組織形態(tài)學及卵泡密度觀察：觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)及卵泡的形態(tài)；隨機選取5個視野，用5 mm×5 mm網(wǎng)格微尺計數(shù)，計算每平方毫米內(nèi)卵泡的數(shù)量，即卵泡密度。

1.7.3增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達情況：陽性細胞定位于卵母細胞及顆粒細胞核，呈棕黃色。卵母細胞核及>50%的顆粒細胞出現(xiàn)棕色時，視為PCNA蛋白表達陽性。計算PCNA蛋白表達率。PCNA陽性卵泡率=(PCNA陽性卵泡個數(shù)/卵泡總個數(shù))×100%。

2結(jié)果

2.1移植卵巢組織的存活情況大鼠卵巢組織移植后，存活的卵巢組織均清晰可見，表面紅潤，呈球形或橢圓形，周圍可見血管供應(yīng)；移植失敗的卵巢組織呈纖維化狀態(tài)，黃白色，周圍組織血供不明顯，見圖1。A、B組分別移植成功13、5只大鼠，存活率分別為65%、25%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2卵泡形態(tài)和密度卵巢組織移植后可見大量原始卵泡及竇狀卵泡，間質(zhì)可見大量新生血管。A、B和D組卵巢組織中卵泡密度分別為(5.17±0.47)、(2.07±0.28)和(7.75±0.38)個/mm3，3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3血清E2水平A、B、C和D組移植后動情期血清E2水平分別為(59.61±6.85)、(28.38±8.47)、(2.59±1.19)和(79.56±12.07)ng/L，A、B組均高于C組，低于D組，且A組高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4卵巢組織中PCNA表達水平A、B和D組卵泡PCNA陽性表達率分別為(76.24±2.59)%、(40.7±2.86)%和(87.47±3.27)%，3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大鼠移植卵巢組織中PCNA表達情況見圖3。

圖1卵巢組織移植后的子宮及移植物的存活情況(黑箭頭為子宮，白箭頭為卵巢組織)A.纖維化的黃色卵巢組織，子宮萎縮；B.卵巢組織存活，表面可見卵泡發(fā)育，子宮飽滿

圖2卵巢組織移植后卵泡形態(tài)(HE×400)A.新鮮移植組；B.直接覆蓋玻璃化冷凍組

圖3移植后卵巢組織增殖細胞核抗原表達情況(PCNA×200)A.新鮮移植組；B.直接覆蓋玻璃化冷凍組

3討論

移植凍融卵巢組織的首要前提是卵巢組織冷凍成功。冷凍時，卵巢組織可能發(fā)生各種冷凍損傷，冰晶形成是最主要的損傷，玻璃化冷凍技術(shù)避免了冰晶的形成。本研究采用的DCV技術(shù)是對常規(guī)玻璃化冷凍方法的改良，是采用玻璃化冷凍方法對卵巢組織進行預(yù)處理，然后直接用液氮覆蓋在預(yù)處理的卵巢組織，之后再進行冷凍保存的方法，因為卵巢組織與液氮直接接觸，降溫速度更快，卵泡損傷減少，冷凍效率更高，本方法最早由Chen等[4]報道。之后又有學者利用此方法對卵巢組織冷凍進行了研究，發(fā)現(xiàn)此方法比傳統(tǒng)的玻璃化冷凍更有利于保存卵巢組織[5]。但是由于卵巢組織結(jié)構(gòu)復雜，含有多種不同類型的細胞，每種細胞對冷凍條件要求不同，而且冷凍保護劑都有一定毒性，因此冷凍過程會導致部分卵泡損傷、丟失。本研究結(jié)果顯示，B組卵巢組織的存活率較A組低也證明了這一點。2004年，Donnez等[6]首次報道了采用程序冷凍方法保存的卵巢組織在解凍后經(jīng)自體原位移植，患者最終成功分娩一名女嬰。Klocke等[7]研究結(jié)果表明，程序化冷凍和玻璃化冷凍方法在卵泡存活和卵巢組織形態(tài)學方面沒有明顯差異。程序化慢速冷凍方法成熟，但由于操作復雜、儀器昂貴、需要大量的液氮，冷凍時很難避免冰晶的形成，對細胞和細胞間連接都有不同程度損傷。大量冰晶在凍融時還會產(chǎn)生凍融效應(yīng)，再次造成對細胞核、細胞連接的損傷，因此在許多生殖中心實際應(yīng)用中已廣泛被玻璃化冷凍替代。

移植物的體積也會影響冷凍和移植效果。參考以前研究者的方法[8-9]，本研究采用的是厚度小、面積大的小體積方法進行卵巢組織冷凍和移植。其優(yōu)勢有以下幾方面：①表面積大、厚度薄利于CPA的滲透，能使卵巢組織內(nèi)細胞迅速脫水而達到“玻璃化”狀態(tài)，保證了冷凍效果，能更好保存各級卵泡。②薄的組織塊移植后與周圍組織有更大的接觸面積，有利于移植物重新建立血供，減少了移植后因缺血而導致的再灌注損傷。③本研究將卵巢組織移植于大鼠下肢肌肉中，此部位血運較豐富，有利于移植物存活，而且Dath等[10]和Soleimani等[11]的研究也證實了這一點。本研究結(jié)果顯示，A組及B組血清E2水平高于C組，提示手術(shù)摘除卵巢組織徹底，無殘留卵巢組織，新鮮及凍融的卵巢組織經(jīng)移植后都有卵泡存活，并具備一定的內(nèi)分泌功能。而B組各項指標均低于A組，可能是由于凍融過程中損失一定的卵泡，這與目前的研究[12-14]是一致的。因此，探索更合理的卵巢組織冷凍方案，最大程度減少冷凍副損傷、降低卵泡丟失率，提高移植存活效果，是今后的工作難點和重點。

迄今，全世界已經(jīng)有10余例通過移植冷凍的卵巢組織獲得妊娠的患者，雖然這些學者應(yīng)用的卵巢組織冷凍方案各不相同，但是，這些案例給了我們很大的鼓舞，尤其最近Dittrich等[15]的報道對卵巢冷凍移植的20例腫瘤患者進行統(tǒng)計，其中19例卵巢功能得到恢復，7例妊娠，4例生育健康嬰兒。相信隨著研究的深入，將為更多需要冷凍卵巢組織保存生育力的患者帶來希望。

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(收稿時間：2015-01-17修回時間：2015-03-03)

女性生育力保存技術(shù)專題研究

·論著·

A Study on the Heterotopic Autotransplantation Transplantation with Ovarian Tissues after Cryopreserved Thawed in Rats

LI Dong-xiu, GENG Yang-liu, WU Xiao-hua, YU Xiao-hui, ZHANG Min, XU Qing-hua (Center of Reproductive Medicine, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of direct cover vitrification (DCV) method in freezing ovarian tissues and to analyze the viability and endocrinic function after the autologous heterotopic transplantation in rats. MethodsA total of 50 mature female rats were randomly divided into group A (n=20), group B (n=20), group C (n=5) and group D (n=5). Group A was transplanted with fresh tissues; group B was transplanted with cryopreserred thawed tissues after being cryopreserved for 2 weeks by DCV method; the bilateral ovarian tissues in group C were cut off, and group D underwent sham operations. After autologous heterotopic transplantation for 6 weeks, serum estradiol (E2) levels were detected, and values of follicular density were calculated; histomorphology changes of transplanted ovaries and expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were observed. ResultsThe vascularity was found in surrounding tissues of survival ovaries, while fibering and unconspicuous vascularity were found in unsuccessfully transplanted ovary tissues. The survival rate of grafts in group B was lower than that in group A (P<0.05). The value of follicular density in group B was lower than those in group A and D, and the value in group A was lower than that in group D (P<0.05). The serum E2levels in group A and B were higher than that in group C, but the values were lower than that in group D (P<0.05). The positive rates of PCNA in group A and B were lower than that in group D, and the rate in group B was lower than that in group A (P<0.05). ConclusionSome ovarian tissues with autologous heterotopic transplantation after DCV and resuscitation method can survive and rehabilitate cover endocrine function.

[Key words]Ovary； Vitrification； Cryopreservation； Graft survival； Transplantation, autologous； Rats, Wistar

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.002

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R715；R-332A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0006-03

[通訊作者]吳小華，E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金項目][作者單位]050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院生殖醫(yī)學中心