促卵泡激素和血管內(nèi)皮生長因子在大鼠卵巢組織冷凍自體異位移植中的保護(hù)作用

李冬秀，耿楊柳，吳小華，張　敏，徐清華，于曉惠，許鵬宇

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促卵泡激素和血管內(nèi)皮生長因子在大鼠卵巢組織冷凍自體異位移植中的保護(hù)作用

李冬秀，耿楊柳，吳小華，張敏，徐清華，于曉惠，許鵬宇

[摘要]目的探討促卵泡激素(FSH)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在大鼠卵巢組織冷凍自體異位移植后對卵泡內(nèi)分泌功能的影響。方法Wistar大鼠30只隨機(jī)分為A、B、C組，每組10只，A組為新鮮卵巢組織移植，B組和C組卵巢組織均直接覆蓋玻璃化冷凍保存2周復(fù)蘇后移植，但C組在移植前2 d肌內(nèi)注射FSH和VEGF，連續(xù)用藥5 d。移植6周后計算卵泡密度；檢測大鼠血清中雌二醇(E2)水平；卵巢組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況，并測定子宮重量。結(jié)果A、B、C組移植后卵巢組織存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A、C組卵泡密度、血清E2水平、PCNA陽性率和子宮重量均高于B組(P<0.05)，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論大鼠卵巢組織冷凍復(fù)蘇自體異位移植前注射FSH和VEGF可以有效提高卵泡存活率，有利于恢復(fù)卵巢內(nèi)分泌功能。

[關(guān)鍵詞]卵泡刺激素；血管內(nèi)皮生長因子類；卵巢；低溫保存；移植,自體；大鼠,Wistar

卵巢組織冷凍移植作為非常有希望同時解決保存女性生育力和內(nèi)分泌功能的方法，從Okay等[1]第一次嘗試用冷凍的卵巢組織移植后得到胚胎，到2004年Donnez等[2]報道了世界第一例卵巢組織冷凍移植嬰兒的問世，給了需要卵巢組織冷凍保存的女性很大的期待，也給了醫(yī)務(wù)工作者們莫大的鼓舞，這一研究課題也成了生殖領(lǐng)域、腫瘤學(xué)科等關(guān)注的熱點。但是，由于卵巢組織細(xì)胞類型復(fù)雜，間質(zhì)細(xì)胞多，含有人體最大的細(xì)胞(卵母細(xì)胞)，在冷凍和復(fù)蘇過程中容易發(fā)生副損傷，為了更大化保存其中的卵泡及細(xì)胞，在近20年圍繞卵巢組織冷凍方案開展的研究眾多，從最初的慢速程序化冷凍到玻璃化冷凍，再到Chen等[3]報道的直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification， DCV)方法，從冷凍保護(hù)劑濃度到各種載體的探索，卵巢組織冷凍的損傷已經(jīng)明顯降低，卵泡保存相對提高。但是，目前卵巢組織復(fù)蘇后移植尚有許多問題未得到解決，如何提高移植物的存活率及最大程度恢復(fù)移植物功能的研究相對較少。本研究采用冷凍大鼠卵巢組織自體異位移植前肌內(nèi)注射促卵泡激素(FSH)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，觀察其對于移植物存活和卵泡發(fā)育的影響，以期為提高卵巢組織冷凍移植的存活率提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組成熟雌性Wistar大鼠30只，8～10周齡，體重200～220 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物研究中心。隨機(jī)分為A、B、C組，每組10只。A組(新鮮卵巢組織移植)：手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢組織后將新鮮卵巢皮質(zhì)進(jìn)行自體異位移植；B組：手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢組織，采用DCV方法冷凍卵巢組織，冷凍保存2周后復(fù)蘇，進(jìn)行自體異位移植；C組：方法同B組，只是在移植前2 d開始肌內(nèi)注射FSH 5 mU/d，VEGF 20 ng/d，連續(xù)用藥5 d。本研究經(jīng)解放軍白求恩國際和平醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),于該院動物實驗中心進(jìn)行，該中心達(dá)到SPF條件。對動物處置符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求。

1.2卵巢組織標(biāo)本取材給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒、開腹，手術(shù)切除雙側(cè)完整卵巢。用生理鹽水反復(fù)沖洗卵巢組織至少3遍，至表面清潔，將卵巢皮質(zhì)切成體積2 mm×2 mm×4 mm的小塊，備用。術(shù)后對大鼠手術(shù)切口進(jìn)行聚維酮碘消毒，肌內(nèi)注射青霉素，2/d，連續(xù)用藥7 d。

1.3DCVDCV過程參考Chen等[3]的方法，所有操作均在室溫下進(jìn)行，將卵巢組織塊浸入平衡液[7.5%乙二醇(v/v)+7.5%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，滲透平衡15 min，再移入冷凍液[15%乙二醇(v/v)+15%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，滲透平衡5 min。輕柔夾取卵巢皮質(zhì)，置于1.8 ml的無菌冷凍管中，將冷凍管用清潔液氮充滿，密封冷凍管，投入貯存液氮罐中備用。

1.4復(fù)蘇過程2周后從液氮罐中取出冷凍管，37℃水浴中解凍30 s，將卵巢組織塊依次移入含0.5、0.25、0.125 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液的解凍液中，每個濃度各停留5 min，再用含20%胎牛血清的DMEM沖洗卵巢組織2次。

1.5自體異位移植于大鼠左側(cè)后肢做一長0.8 cm的縱切口，將新鮮或凍融卵巢組織塊移植于肌肉中，常規(guī)縫合，術(shù)后對手術(shù)切口進(jìn)行聚維酮碘消毒，肌內(nèi)注射青霉素，2/d，連續(xù)用藥7 d。

1.6移植后大鼠情況及移植物的取出卵巢組織移植后3 d開始每日行陰道涂片，顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞類型，出現(xiàn)動情周期的大鼠依據(jù)陰道上皮類型進(jìn)行判定，未出現(xiàn)動情周期的大鼠觀察角化細(xì)胞，角化細(xì)胞比例>50%則認(rèn)為有雌激素樣效應(yīng)。斷頭法處死大鼠，取血測定血清中雌二醇(E2)水平，手術(shù)剝除移植物備用，同時手術(shù)摘除大鼠子宮，稱重子宮重量。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察：固定器固定大鼠后，取生理鹽水0.1～0.2 ml注入大鼠陰道，輕輕吹打，使陰道脫落細(xì)胞融入生理鹽水，將吹打后的生理鹽水涂至玻片上，自然干燥，HE染色后光鏡下觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：動情前期，以橢圓形有核上皮細(xì)胞為主，偶有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞；動情期，無核角化細(xì)胞呈片狀為主，偶有少量上皮細(xì)胞和白細(xì)胞；動情后期，白細(xì)胞、片狀角化細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞并存，三者數(shù)目相當(dāng)；動情間期，大量白細(xì)胞及少量有核上皮和角化上皮細(xì)胞。

1.7.2血清E2水平測定：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清E2水平，根據(jù)陰道脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)果，在動情期留取血清，測定E2水平。

1.7.3卵泡密度：觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)及卵泡的形態(tài)及密度。隨機(jī)選取5個視野，在100倍視野下，用5 mm×5 mm網(wǎng)格微尺計數(shù)，計算每平方毫米內(nèi)卵泡的數(shù)量，即卵泡密度。

1.7.4增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達(dá)情況：陽性細(xì)胞定位于卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞核，呈棕黃色。卵母細(xì)胞核及>50%的顆粒細(xì)胞出現(xiàn)棕色時，視為PCNA表達(dá)陽性。計算PCNA蛋白表達(dá)率，PCNA陽性卵泡率=(PCNA陽性卵泡個數(shù)/卵泡總個數(shù))×100%。

1.7.5子宮重量測量：于處死大鼠當(dāng)日手術(shù)摘除子宮，去除周圍系膜及組織稱重。

2結(jié)果

2.1移植物存活情況移植6周后取出移植物觀察，卵巢組織均清晰可見，表面紅潤，生長呈球形或橢圓球形，周圍可見血管供應(yīng)，與周圍組織間可見豐富毛細(xì)血管，偶有斑點狀纖維化區(qū)域，為移植成功。移植物呈纖維化狀態(tài)，黃白色，與周圍組織血供不明顯、質(zhì)地偏硬者判定為移植失敗。A組1例、B組3例、C組2例移植失敗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對于移植失敗者，則不再進(jìn)行血清E2測定、卵泡密度計數(shù)及PCNA檢測，也不再進(jìn)行子宮重量測量。

2.2卵泡密度A、B、C組卵巢組織中卵泡的密度分別為(5.17±0.47)、(2.07±0.28)和(5.05±0.31)個/mm3。A、C組卵泡密度高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3血清E2水平A、B、C組血清E2水平分別為(59.61±6.85)、(28.38±8.47)、(58.99±8.63)ng/L。A、C組血清E2水平高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4PCNA表達(dá)情況A、B、C組卵泡PCNA陽性表達(dá)率分別為(76.24±2.59)%、(40.7±2.86)%、(73.93±4.33)%。A、C組PCNA陽性表達(dá)率均高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5子宮重量A、B、C組子宮重量分別為(1.39±0.09)、(1.10±0.12)和(1.36±0.10)g。A、C組子宮重量高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

近年來，卵巢組織冷凍和卵巢移植取得了一些進(jìn)步，迄今已有20余例嬰兒通過自體移植冷凍卵巢組織出生[4-5]。但是，移植最初幾天卵泡的丟失明顯限制了這一領(lǐng)域的發(fā)展[6-7]。卵巢組織冷凍損傷過程可能會損失一部分卵泡，在移植后由于缺血、缺氧對卵泡損失的影響更明顯，如何使卵巢移植物度過缺血、缺氧的敏感期，盡量減少由于微循環(huán)缺失而導(dǎo)致的移植失敗，也是研究的重點之一，已經(jīng)有學(xué)者進(jìn)行了一些有益的探索，但是，在移植過程中如何減少卵泡損失的研究尚少，學(xué)者們還未達(dá)成共識。

為了盡可能完整保存卵泡、提高移植成功率，學(xué)者們從卵巢組織冷凍方案、移植部位、移植時的處理等多方面進(jìn)行了探索。人類自體移植卵巢組織可以進(jìn)行原位移植，也可以異位移植到前臂皮下、腹壁等部位。在動物實驗中，為了提高移植成功率，選擇血液供應(yīng)豐富的部位進(jìn)行移植是大家的共識，腎被膜下、腹膜內(nèi)、肌肉組織等都是容易移植成功的部位。本研究采用的移植部位為大鼠后肢大腿肌肉，這個部位與腎被膜下相比，血液循環(huán)稍差，但是Abir等[8]認(rèn)為這樣更能模擬卵巢真正生長的盆腔環(huán)境，而且前期部分學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)，肌肉組織血管重建的效果優(yōu)于皮下組織，卵巢移植存活率也很高[9]。有研究將移植到卵巢窩、皮下、腹膜與肌肉中的人卵巢組織進(jìn)行比較，移植到肌肉中的卵巢組織間質(zhì)纖維化程度明顯低于其他部位移植組[10]。本研究也證實大鼠后肢肌肉組織也是理想的卵巢組織異位移植部位。

玻璃化冷凍方法對卵巢組織中各級卵泡的保存效率比較高。文獻(xiàn)報道冷凍過程丟失卵泡率為7%，而移植后到血管形成前可能有2/3的卵泡丟失，提示原始卵泡的丟失主要集中在移植過程[11-12]。小塊卵巢組織的移植沒有血管吻合，移植后血供完全依靠周圍組織間的毛細(xì)血管，移植后48 h組織缺氧最嚴(yán)重，所以，移植過程卵泡丟失的多少直接決定了移植的成敗。作為發(fā)揮卵巢功能的最基本單位，原始卵泡存留的數(shù)量直接決定了移植后卵巢組織功能的持續(xù)時間。目前報道的卵巢組織移植后功能維持時間從幾個月到7年不等[13-16]。對于卵巢移植后卵巢功能維持時間短的患者，只能依靠再次卵巢移植來保證生活質(zhì)量。減少移植時卵泡的損耗，從患者長期生存需要來說，可以減少移植的次數(shù)，節(jié)約醫(yī)療資源和經(jīng)濟(jì)成本。

為了最大限度保留移植后卵泡的功能，許多學(xué)者做了大量工作，主要為促進(jìn)毛細(xì)血管形成和減少缺氧損傷兩方面。促進(jìn)移植后毛細(xì)血管的形成，盡快建立移植卵巢與周圍組織間血運(yùn)，為移植物提供足夠豐富的血供和氧供，有利于移植物存活。VEGF是可以促進(jìn)毛細(xì)血管形成的因子，對血管生成具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，是目前所知的特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，也是唯一明確有促進(jìn)血管形成的藥物[17]。另據(jù)報道促性腺激素可調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)VEGF水平，因此移植前后給予外源性激素可以促進(jìn)移植后毛細(xì)血管形成。研究發(fā)現(xiàn)，在移植前后注射促性腺激素釋放激素，可使移植卵巢組織中的卵泡數(shù)量明顯增多，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)VEGF等來促進(jìn)血管再生[18]。

本研究結(jié)果顯示，C組卵泡密度、血清E2水平和子宮重量均高于B組，提示卵巢組織內(nèi)分泌功能恢復(fù)優(yōu)于B組；PCNA作為卵泡啟動生長的最早指標(biāo)，本研究結(jié)果也證實C組卵泡組織中PCNA陽性表達(dá)率高于B組。分析原因可能是VEGF和FSH的聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)了移植后卵巢組織與周圍肌肉之間更快的毛細(xì)血管形成，縮短了缺血、缺氧時間；另外，F(xiàn)SH可能促進(jìn)了一些卵泡的生長，減少了卵泡丟失，因而更好地保存了卵泡。而Schnorr等[19]的研究認(rèn)為，在移植前注射VEGF并沒有改善移植卵巢組織的活性，分析原因可能與用藥時間有關(guān)。Imthurn等[18]認(rèn)為在移植前后2 d用促性腺激素有助于提高卵泡存活率，用藥過晚(移植后開始)和用藥時間過長都可能導(dǎo)致用藥無效,分析原因可能是由于VEGF需要在移植前合成一段時間才能達(dá)到一定的作用量，至少可在移植后最容易發(fā)生缺血、缺氧的時期發(fā)揮作用，以促進(jìn)毛細(xì)血管形成。

綜上所述，卵巢組織冷凍移植效果與冷凍技術(shù)、移植部位及移植方法等多種因素相關(guān)，如何全面提高卵巢組織移植技術(shù)，還需要進(jìn)行更深入、更系統(tǒng)的研究。

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(收稿時間：2015-02-10修回時間：2015-03-15)

·論著·

Protective Effects of FSH and VEGF on Ovarian Tissues Vitrification and Autotransplantation in Rats

LI Dong-xiu, GENG Yang-liu, WU Xiao-hua, ZHANG Min, XU Qing-hua, YU Xiao-hui, XU Peng-yu (Center of Reproductive Medicine Center, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of follicle stimulating hormone (FSH) and vascular endothelial growth factor (VEGF) on follicular endocrinic function of ovarian tissues after vitrification and autologous heterotopic transplantation. MethodsA total of 30 female Wistar rats were randomly divided into group A, B and C (n=10 for each group). Group A was transplanted with fresh tissues; group B and C were transplanted with resurgent tissues after cryopreserved for 2 weeks by direct cover vitrification (DCV) method, but group C received FSH and VEGF with intramuscular injection 2 d before the transplantation for consecutive 5 d. After heterotopic auto transplantation for 6 weeks, values of follicular density were calculated; serum estradiol (E2) levels were detected; expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were detected, and the values of uterine weight were measured. ResultsThere were no statistically significance differences in survival rates of ovarian tissues among the 3 groups (P>0.05). The values of follicular density, serum E2level, positive rate of PCNA and uterine weight in group A and C were higher than those in group B (P<0.05), but there were no statistically significant differences in the values between group A and C (P>0.05). ConclusionVEGF and FSH of intramuscular injection before the transplantation for ovarian tissues after vitrification and resuscitation can effectively increase the survival rate of ovarian tissues and improve the recovery of follicular endocrinic function.

[Key words]Follicle stimulating hormone； Vascular endothelial growth factors； Ovary; Cryopreservation; Transplantation, autologous; Rats, Wistar

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.04

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號]R715；R-332A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0013-04

[通訊作者]吳小華，E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金項目][作者單位]050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心