電針三陰交、陰陵泉對腓腸肌損傷大鼠損傷后修復及生長因子表達的影響

連曉陽，陳少清，方憶生，王詩忠，林建平

電針三陰交、陰陵泉對腓腸肌損傷大鼠損傷后修復及生長因子表達的影響

連曉陽，陳少清，方憶生，王詩忠，林建平

[摘要]目的探討電針治療腓腸肌損傷的可能機制。方法30只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為空白組(n=10)、模型組(n=10)和電針組(n=10)。模型組和電針組采用腓腸肌鈍挫傷的方法制備模型，電針組電針三陰交、陰陵泉穴14 d。治療結束后取腓腸肌組織行HE染色，免疫組化法檢測大鼠腓腸肌組織、ELISA法檢測大鼠血清堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)的表達。結果與模型組相比，電針組損傷程度較輕，腓腸肌組織bFGF、IGF-1表達明顯升高(P<0.01)，血清含量升高(P<0.05)。結論電針可以促進腓腸肌損傷大鼠損傷后修復，其機制可能與上調修復因子bFGF和IGF-1的表達水平有關。

[關鍵詞]腓腸肌損傷；電針；堿性成纖維細胞生長因子；胰島素樣生長因子-1；大鼠

[本文著錄格式]連曉陽，陳少清，方憶生，等.電針三陰交、陰陵泉對腓腸肌損傷大鼠損傷后修復及生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(11): 1273-1276.

CITED AS: Lian XY, Chen SQ, Fang YS, et al. Effects of electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan acupoints on muscle repair and expression of growth factors in gastrocnemius muscle damaged rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(11): 1273-1276.

肌肉骨骼系統損傷是意外傷害中發病率最高的一類損傷[1]，腓腸肌損傷在劇烈活動的運動員中尤為常見[2]。有研究表明，電針三陰交等穴可促進腓腸肌損傷的修復[3-4]，但其機制尚未完全闡明。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族成員之一[5]，在FGF家族中，抗組織損傷和促進修復方面作用最強[6]；胰島素樣生長因子-1 (insulin-likegrowth factor-1, IGF-1)是一類廣譜性促生長因子[7]，對骨骼肌的生長、分化起重要作用[8]。b-FGF和IGF-1均是肌肉損傷修復過程中的重要因子。本研究觀察電針三陰交、陰陵泉穴對腓腸肌損傷后組織和血清中bFGF及IGF-1表達的變化，探討電針三陰交、陰陵泉穴治療腓腸肌損傷的可能機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

清潔級8周齡健康Sprague-Dawley雄性大鼠30只，體質量(200±20) g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCK(滬)2012-0002。

1.1.2儀器

DM IL LED倒置顯微鏡：LEICA儀器有限公司。Multiskan MK3全自動酶標儀、Heraeus PICO 17低溫高速離心機：美國THERMO公司。G-6805華佗牌電針儀：上海華誼儀器廠。

1.1.3試劑

兔抗bFGF、IGF-1抗體：博奧森公司。DAB顯色劑：邁新生物技術公司。bFGF、IGF-1酶聯檢測試劑盒：上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組

大鼠實驗前適應性飼養1周。將大鼠編號，隨機數字表法分為空白組(n=10)、模型組(n=10)和電針組(n=10)。

1.2.2造模

采用鈍挫腓腸肌建立大鼠腓腸肌損傷模型[9]。模型組和電針組大鼠術前禁食12 h，禁水4 h。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剪除大鼠右下肢腓腸肌處皮毛。大鼠俯臥位，保持踝關節跖屈90°，使腓腸肌位于脛腓骨內側。標記腓腸肌肌腹中點。打擊器質量500 g，由48 cm處自由落下，垂直打擊標記部位，打擊器與腓腸肌接觸面積約1×1 cm，動能為2.352 J。連續打擊3次。

1.2.3干預

電針組參考《實驗針灸學》等[10-11]取大鼠三陰交和陰陵泉穴，應用華佗牌G-6805電針儀，予疏密波，頻率2/10 Hz，電流強度2 mA，以右后肢出現輕微顫抖為準。每次30 min，每天1次，連續14 d，從造模后第1天開始治療。

空白組、模型組置于普通籠中飼養，不做任何處理。

1.2.4 HE染色

治療14 d后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，銳性切取右后肢腓腸肌肌腹中段的病灶組織約1×1 cm。生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液漂洗，4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，石蠟包埋，切片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木素和伊紅染色，光鏡下觀察組織結構變化。

1.2.5免疫組化染色

將固定滿意的腓腸肌標本制成石蠟切片(方法同上)。60°烤片1 h，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗、熱修復抗原，PBS沖洗封閉，一抗4℃孵育過夜，加二抗、三抗、DAB顯色，大量自來水沖洗。蘇木素復染、鹽酸分色，PBS返藍，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析。高倍鏡下(200倍)取5個視野，測量其平均光密度值(MD)。

1.2.6 ELISA

10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰臥固定在解剖臺上，經腹主動脈取血4 ml。4℃4000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中，-20℃保存備測。

從酶聯檢測試劑盒取出包被有抗bFGF或IGF-1特異抗體的酶標板，每孔加入標準品和待測大鼠血清100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，加入生物素化抗大鼠bFGF或IGF-1抗體100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，加入辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，每孔加入TMP顯色液100 μl，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μl。15 min內在450 nm測定OD值；據樣品OD值在標準曲線上查出其濃度。

1.3統計學分析

應用SPSS18.0軟件進行統計學處理。各組數據以(xˉ±s)表示。符合正態分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；不符合正態分布，采用多組樣本秩和(Kruskal-Wallis)檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1HE染色

模型組肌纖維排列紊亂，可見大量破裂肌纖維，炎細胞浸潤明顯，肌纖維腫脹伴有透明樣變性，肌纖維明顯壞死。電針組肌組織內瘀血、水腫、出血灶大部分消失，血管增生，膠原纖維增生，與正常軟組織相比較已基本恢復正常；新生肌纖維排列整齊，炎癥基本吸收。空白組未見病理改變(圖1)。

2.2免疫組化染色

與空白組相比，模型組腓腸肌組織中bFGF和IGF-1表達水平上升(P<0.05)。與模型組相比，電針組腓腸肌組織中bFGF和IGF-1表達水平明顯上升(P< 0.01)。見圖2、圖3、表1。

圖1　各組大鼠腓腸肌病理改變(HE染色，200×)

圖2　各組大鼠腓腸肌bFGF表達(免疫組化染色，200×)

圖3　各組大鼠腓腸肌IGF-1表達(免疫組化染色，200×)

2.3ELISA

與空白組相比，模型組血清中bFGF和IGF-1含量明顯上升(P<0.01)。與模型組相比，電針組血清中bFGF和IGF-1含量上升(P<0.05)。見表2。

表2　各組血清bFGF、IGF-1水平(ng/ml)

3　討論

肌肉損傷在所有運動損傷中約占10%～55%[12]，鈍挫傷是常見的損傷類型之一[1]。損傷的肌肉通常可以通過肌肉再生進行修復，但不能完全恢復其結構和功能[13]。

現代研究已證實，電針能促進骨骼肌肌衛星細胞的增殖與分化，進而促進腓腸肌損傷的修復[14-15]。中醫認為，脾主肌肉，肌肉疾病皆可從脾入手。三陰交、陰陵泉均為脾經要穴。本研究顯示，電針三陰交、陰陵泉可以促進腓腸肌損傷大鼠損傷后修復。與其他研究結果一致[3,16]。

FGF是目前已知最大的生長因子家族之一[17]。bFGF是重要的有絲分裂促進因子，也是形態發生和分化的誘導因子，在正常生理及病理過程中參與生長發育和組織損傷的修復過程[18]。Xu等研究表明，bFGF能促進失神經腓腸肌的肌衛星細胞增殖，延緩肌纖維萎縮和抑制肌纖維結締組織增生[19]。張朝研究發現，bFGF在損傷后7 d內陽性表達呈現上升趨勢，并在7～14d達到峰值[20]。馮鑫等研究發現，外源性bFGF可以降低損傷肌肉組織中波形蛋白的特異性表達及肌肉組織纖維化程度，促進肌肉損傷后結構及功能的恢復[21]。同時，bFGF可以促進肌肉拉傷后結蛋白表達，提高肌肉再生能力[22]。

IGF-1是一類廣譜的促生長因子，化學結構與胰島素原類似[23]。在骨骼肌的增殖階段，IGF-1可以增加衛星細胞的增殖和分化。

IGF-1對肌肉再生的調節由多信號通路介導。IGF-1與其受體的α亞基結合后，可使β亞基自身磷酸化，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。MAPK通路可將信號傳至核內，啟動與細胞增殖有關的靶基因轉錄，發揮促進細胞增殖、浸潤和轉移的效應[24]。

IGF-1可通過IGF-1受體發揮生長激素的局部效應。IGF-1受體位于細胞漿內，部分具有酪氨酸激酶活性功能，可刺激肌纖維對氨基酸的利用，促進蛋白質合成；還可抑制蛋白質的降解，從而提高蛋白質的凈增率[25]。

因此，IGF-1可通過調控細胞增殖，增加蛋白質合成，減少蛋白質降解等途徑促進骨骼肌損傷后的修復與再生。

本研究表明，電針在一定程度上可以上調腓腸肌組織和血清中bFGF和IGF-1的表達，這可能是電針促進腓腸肌損傷后修復的機制之一。

綜上所述，電針三陰交、陰陵泉可促進腓腸肌損傷后修復，其作用機制可能與上調bFGF和IGF-1在腓腸肌組織和血清中表達水平有關。

由于腓腸肌損傷的機制復雜，以及電針多靶點的綜合作用，其確切機制還需要進一步深入研究。

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·綜述·

Effects of Electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan Acupoints on Muscle Repair and Expression of Growth Factorsin GastrocnemiusMuscleDamaged Rats

LIANXiao-yang, CHENShao-qing, FANGYi-sheng, WANGShi-zhong, LINJian-ping
Fujian University of Traditional ChineseMedicine, Fuzhou, Fujian350122, China

Abstract:ObjectiveTo investigatetheeffectsof electroacupunctureat Sanyinjiao (SP6) and Yinlingquan (SP9) on musclerepair in the gastrocnemiusmuscledamaged ratsand itspossiblemechanism. Methods30 male Sprague-Dawley ratswererandomly divided into blank group (n=10), model group (n=10) and electroacupuncture group (n=10). The latter 2 groups were modeled with gastrocnemius muscle crush injury. Theelectroacupuncturegroup received electroacupunctureat Sanyinjiao and Yinlingquan for 14 days. Their gastrocnemiuswas observed with HE staining, and theexpressionsof basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-likegrowth factor-1 (IGF-1) in gastrocnemius tissues and the serum were determined with immunochemical assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the model group, there was less damage in the electroacupuncture group, with more expression of bFGF and IGF-1 in tissues (P<0.01) and serum (P<0.05). Conclusion Electroacupuncture can promote muscle repair after gastrocnemius muscle damage in rats, whichmay berelatedtotheincreaseof thebFGFand IGF-1expressioningastrocnemiustissueandserum.

Keywords:gastrocnemiusmuscledamage; electroacupuncture; basicfibroblast growthfactor; insulin-likegrowthfactor-1; rats

(收稿日期：2015-08-02修回日期：2015-08-31)

作者簡介：作者單位：福建中醫藥大學，福建福州市350122。連曉陽(1990-)，男，漢族，福建三明市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱疾病康復的基礎與臨床研究。通訊作者：林建平(1985-)，女，漢族，福建福州市人，碩士，醫師，主要研究方向：脊柱疾病康復的基礎與臨床研究。E-mail: 283959283@qq.com。

基金項目：1.國家自然科學基金項目(No.81303017)；2.校管課題重點學科專項(No.X2014081-學科)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.008

[中圖分類號]R685

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)11-1273-04