SLC30A8、CDKN2A/2B 、HHEX 、TCF7L2基因多態性與中國東北漢族人2型糖尿病的關聯

陳　琰　趙　瑩　劉桂鋒(吉林大學第二醫院內分泌科，吉林　長春　3004)

SLC30A8、CDKN2A/2B 、HHEX 、TCF7L2基因多態性與中國東北漢族人2型糖尿病的關聯

陳琰趙瑩劉桂鋒1
(吉林大學第二醫院內分泌科，吉林長春130041)

〔摘要〕目的探討SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因多態性與中國東北漢族人群2型糖尿病(T2DM)的相關性。方法應用連接酶檢測反應(LDR)技術對中國吉林省長春地區113例T2DM患者及107例正常對照(NC)者SLC30A8基因rs13266634位點、CDKN2A/2B基因rs10811661位點、HHEX基因rs1111875位點、TCF7L2基因rs7903146位點的SNP進行檢測。結果SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的空腹胰島素(FINS)、胰島B細胞功能(HOMA-B)均低于TT基因型(P＜0．05)，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)均高于TT基因型(P＜0．05)，CC基因型的空腹血糖(FPG)高于TT基因型(P＜0．05)。三組CC、CT、TT基因型合并心血管并發癥的構成比，差異有統計學意義(P＜0．05)。CDKN2A/2B (rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0．05)，FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、TC均高于CC基因型(P＜0．05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0．05)。三組CC、CT、TT基因型合并微血管并發癥的構成比差異有統計學意義(P＜0．05)。HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0．01)，FPG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因組的低密度脂蛋白膽固醇(LDL) -C高于AA基因組(P＜0．05)。三組GG、GA、AA基因型合并心血管并發癥的構成比差異有統計學意義(P＜0．05)。結論SLC30A8基因多態性位點rs13266634、HHEX基因多態性位點rs1111875與T2DM心血管并發癥存在一定的相關性，CDKN2A/2B基因多態性位點rs10811661與T2DM微血管并發癥存在一定的相關性。

〔關鍵詞〕2型糖尿病;單核苷酸多態性

1吉林大學中日聯誼醫院放射線科

第一作者:陳琰(1982-)，女，博士，主治醫師，主要從事2型糖尿病的防治研究。

2型糖尿病(T2DM)是多基因和環境因素共同作用的一種復雜性疾病。SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因是2007年Nature和Science上首批鑒定出的與歐洲白種人T2DM發病相關的基因〔1～5〕，但這些變異對于具有不同遺傳背景的中國東北漢族人群T2DM患病率的影響尚不清楚。本研究旨在探討應用連接酶檢測反應(LDR)技術SLC30A8基因rs13266634位點、CDKN2A/2B基因rs10811661位點、HHEX基因rs1111875位點、TCF7L2基因rs7903146位點的SNP與中國東北漢族人群T2DM的相關性。

1　材料與方法

1.1研究對象T2DM組:按知情同意的原則收集2011年12月至2013年12月在我科確診為T2DM的門診或住院患者113例。納入標準:①符合1999年WHO糖尿病診斷〔空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L〕及分型標準;②半年內無酮癥及其他應激情況;③無肝腎功能不全。對照組:遵循知情同意的原則收集同期在醫院進行健康體檢的無糖尿病家族史的健康者107例。兩組研究對象均為長春地區漢族人群，且個體間無血緣關系。受試者禁食8 h以上，晨起空腹抽取肘靜脈血2 ml，檸檬酸鈉抗凝，用于提取基因組DNA。同時進行人體測量血并留取空腹血標本用于檢測代謝指標，采用穩態模型評估胰島素抵抗指數(HOMA-IR)和胰島β細胞功能(HOMA-B)。

1.2實驗方法

1.2.1血液基因組DNA提取采用北京天根生化科技有限公司(離心柱型)試劑盒提取人基因組DNA。

1.2.2PCR反應應用生物軟件Oligo6.0設計PCR引物，見表1。以基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件:總體系15 μl，模板1 μl，10×buffer 1.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP 0.3 μl，引物混合0.15 μl，Taq酶0.3 μl。擴增條件: 94℃3 min，94℃15 s，55℃15 s，72℃30 s，35個循環，72℃3 min。PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

表1　PCR反應引物序列

1.2.3多重LDR反應根據LDR探針設計原則設計LDR上下游探針，見表2。LDR反應體系: PCR產物3 μl，10×Taq DNA ligase buffer 1 μl，Taq DNA ligase (40 U/μl) 0.125 μl，探針(10p) 0.01 μl/條，加H2O補至10 μl。LDR反應條件: 94℃30 s，56℃3 min，進行30個循環。取1 μl延伸產物，加8 μl上樣loading，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。

1.3統計學方法以Hardy-Weinberg平衡法檢測各組基因頻率的群體代表性。應用SPSS17.0軟件進行正態性檢驗、方差分析和χ2檢驗。

2　結果

2.1基因分型檢測結果多重PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢驗結果見圖1。多重LDR結果見圖2。

表2　LDR反應探針序列

圖1　PCR產物的凝膠電泳結果

圖2　基因分型的多重LDR峰圖

2.2基因型頻率和等位基因頻率分析

2.2.1SLC30A8(rs13266634)兩組中CC、CT、TT基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組CC、CT、TT基因型頻率分別為38.9％、48.7％、12.4％，對照組分別為33.6％、51.4％、15％，差異無統計學意義(χ2= 0.770 3，P = 0.68)。T2DM組C和T等位基因頻率分別為63.3％和36.7％，對照組分別為59.3％和40.7％，差異無統計學意義(OR =1.180 2，95％CI=0.803 8～1.733 0，χ2=0.715 5，P=0.39)。

2.2.2CDKN2A/2B(rs10811661)兩組中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組TT、CT、CC基因型頻率分別為31％、47.8％、21.2％，NC組分別為29.9％、50.5％、19.6％，差異無統計學意義(χ2= 0.170 8，P = 0.91)。T2DM組T和C等位基因頻率分別為54.9％和45.1％，對照組分別為55.1％和44.9％，差異無統計學意義(OR =1.011 1，95％CI=0.694 4～1.472 3，χ2=0.003 3，P=0.95)。

2.2.3HHEX(rs1111875)兩組中GG、GA、AA基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組GG、GA、AA基因型頻率分別為9.7％、45.2％、45.1％，對照組GG、GA、AA基因型頻率分別為5.6％、44.9％、49.5％，差異無統計學意義(χ2= 1.035 6，P= 0.59)。T2DM組G和A等位基因頻率分別為32.3％和67.7％，對照組G和A等位基因頻率分別為28％和72％，差異無統計學意義(OR=0.833 3，95％CI=0.553 6 ～1.254，χ2=0.764 2，P=0.38)。

2.2.4TCF7L2(rs7903146)兩組中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組TT、CT、CC基因型頻率分別為0％、6.2％、93.8％，對照組分別為0％、1.9％、98.1％，差異無統計學意義(χ2= 2.620 8，P = 0.27)。T2DM組T和C等位基因頻率分別為3.1％和96.9％，對照組分別為1％和99％，差異無統計學意義(OR= 0.295 1，95％CI= 0.060 6～1.437 0，χ2=2.566 1，P=0.11)。

2.3糖尿病組不同基因型人體測量學及代謝指標的比較

2.3.1SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于TT基因型(P＜0.05)，TC、TG均高于TT基因型(P＜0.05)，CC基因型的FPG高于TT基因型(P＜0.05)。CC、 CT、TT基因型合并心血管并發癥的構成比分別為61.4％(27/ 17)、45.5％(25/30)、21.4％(3/11)，三組基因型間的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.2CDKN2A/2B(rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0.05)，FPG、HbA1c、TC均高于CC基因型(P＜0.05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0.05)。CC、CT、TT基因型合并微血管并發癥的構成比分別為29.9％(7/17)、44.4％(24/30)、62.9％(22/13)，三組基因型間的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.3HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0.01)，FPG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因組的LDL-C高于AA基因組(P＜0.05)。GG、GA、AA基因型合并心血管并發癥的構成比分別為72.7％(8/3)、49％ (25/26)、31.4％(16/35)，三組基因型間的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.4TCF7L2(rs7903146)糖尿病組各基因型間的代謝指標差異無統計學意義(P＞0.05)，并發癥的構成比無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3　T2DM組臨床變量與基因型的關系(±s)

表3　T2DM組臨床變量與基因型的關系(±s)

與TT基因型比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與CC基因型比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;與AA基因型比較: 5) P＜0.05，6) P＜0.01; BMI:體重指數; HbA1c:糖化血紅蛋白; TC:總膽固醇; TG:甘油三酯; HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇; FINS:空腹胰島素

指標　SLC30A8(rs13266634)CDKN2A/2B(rs10811661) CC　CT　TT　TT　CT　CC年齡(歲)　51.48±12.13　 51.71±12.22　 57.14±7.7　 52.83±10.8　 51.02±11.1　 54.38±12.3 BMI(kg/m2)　25.48±3.24　 25.35±3.46　 26.87±2.38　 24.77±2.54　 26.02±3.81　 25.77±2.74 FPG(mmol/L)　9.91±2.711)　9.16±2.14　 8.12±1.23　 9.66±2.993)　9.61±2.183)　8.15±0.99 HbA1c(％)　8.70±1.77　 8.39±1.45　 7.85±1.75　 8.65±1.73　 8.62±1.61　 7.73±1.36 TC(mmol/L)　5.59±1.482)　5.44±1.071)　4.49±0.92　 5.49±1.234)　5.66±1.313)　4.59±0.87 TG(mmol/L)　2.83±1.481)　2.56±1.272)　1.52±0.30　 2.91±1.624)　2.59±1.273)　1.86±0.60 HDL-C(mmol/L)　1.13±0.31　 1.20±0.34　 1.09±0.35　 1.18±0.32　 1.13±0.33　 1.19±0.36 LDL-C(mmol/L)　3.24±0.98　 3.32±0.94　 3.28±0.89　 3.35±1.04　 3.36±0.91　 3.02±0.86 FINS(mU/L)　1.47±0.401)　1.48±0.241)　1.69±0.26　 1.48±0.344)　1.46±0.293)　1.65±0.32 HOMA-IR　1.10±0.34　 1.08±0.23　 1.24±0.28　 1.09±0.29　 1.08±0.26　 1.20±0.32 HOMA-B　2.01±0.531)　2.06±0.341)　2.34±0.28　 2.04±0.494)　2.01±0.43)　2.29±0.33指標　HHEX(rs1111875)TCF7L2(rs7903146) GG　GA　AA　CT　CC年齡(歲)　47.7±6.53　52.21±11.7　53.27±11.5　55.29±11.2　52.09±11.3 BMI(kg/m2)　25.9±2.85　25.31±3.54　25.79±3.09　25.47±2.67　25.59±3.32 FPG(mmol/L)　10.59±2.826)　10.23±2.545)　8.13±1.31　8.10±1.38　9.40±2.38 HbA1c(％)　9.26±2.12　8.53±1.48　8.18±1.63　8.50±1.70　8.43±1.63 TC(mmol/L)　6.60±0.905)　5.68±1.355)　4.84±0.93　4.96±0.74　5.41±1.29 TG(mmol/L)　3.01±0.995)　2.92±1.326)　2.04±1.25　2.56±0.84　2.53±1.36 HDL-C(mmol/L)　1.26±0.31　1.15±0.33　1.15±0.34　1.03±0.29　1.17±0.33 LDL-C(mmol/L)　4.7±0.245)　3.16±0.83　3.14±0.92　2.88±0.64　3.31±0.96 FINS(mU/L)　1.33±0.16)　1.42±0.316)　1.62±0.32　1.56±0.46　1.50±0.31 HOMA-IR　0.99±0.1　1.07±0.25　1.18±0.33　1.11±0.45　1.11±0.28 HOMA-B　1.81±0.226)　1.93±0.456)　2.28±0.34　2.22±0.52　2.07±0.42

3　討論

2007年，Nature報道了首個在法國人群的T2DM GWAS，發現SLC30A8、HHEX、EXT2和LOC387761與T2DM的發病風險關聯，同時驗證了TCF7L2與T2DM的相關性。隨后冰島人群研究成功驗證了SLC30A8基因的rs13266634，同時發現了CDKAL1rs7756992，這兩個位點在高加索人和中國香港人中均得到驗證。同一時期，來自3個研究組DGI、WTCCC /UKT2D和FUSION的GWAS發表于同一期Science上，均成功驗證了TCF7L2、KCNJ11、PPARγ、SLC30A8和HHEX區域，還發現了CDKAL1、IGF2BP2和CDKN2A/B〔1～5〕。Wu等〔6〕研究得出CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，SLC30A8基因變異與T2DM發病關，HHEX變異與上海漢族人T2DM發病相關，與北京漢族人發病無關，HHEX基因在北方人群的結果與本研究結果一致。中國香港〔7〕、臺灣〔8〕漢族人研究顯示，TCF7L2基因的rs7903146C/T多態性與T2DM無相關性。中國上海地區漢族人的研究結果提示SLC30A8 (rs13266634)、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)基因多態性與T2DM發病相關〔9〕，與本研究結果不一致。這可能由于本研究樣本量較少導致抽樣偏差以及地區種族的差異所致。

SCL30A8基因位于8號染色體(8q24)，編碼一種在胰腺β細胞分泌囊泡中表達的鋅轉運體8。通過把鋅轉移至有胰島素的囊泡中，來調節胰島素的生物合成、穩定、儲存〔10〕。結合文獻SLC30A8(rs13266634)存在T→C的變異。本研究結果提示rs13266634的C等位基因可能與空腹胰島素分泌不足，胰島功能衰竭相關。Ingelsson等〔11〕也證實SCL30A8基因變異可增加空腹胰島素原水平，其機制可能通過減少胰島β細胞增殖或增加其凋亡來減少β細胞質量，從而使胰島素原轉化成胰島素的分子過程受到損傷。本研究提示C等位基因可能增加心血管并發癥的發病率。Sattar〔12〕在研究糖尿病與心血管疾病的關系中指出在校正了年齡、性別及其他脂質變量的模型中，TC和LDL-C水平增高對心血管疾病的預測價值更高。本研究C等位基因增加心血管并發癥發病率的可能與CC、CT基因型的TC高于TT基因型有關。CDKN2A/2B基因位于9號染色體(9q21)，是一個已知的腫瘤抑制基因，其產物P16抑制細胞周期素依賴性激酶4(CDK4)，而CDK4是一個有效的胰腺β細胞增殖調節劑，CDKN2A/2B基因過表達可導致胰腺發育不全和糖尿病。本研究提示T等位基因與胰島β細胞功能受損，胰島素分泌減少相關，與Wu等〔6〕的研究結果一致。另外TT基因型增加微血管并發癥的發病率，而這是否與FPG、HbA1c高于CC基因型說明長期血糖控制不佳有關還需進一步深入的研究。基因是肝臟和胰腺發育的必須基因，是WNT信號通路作用的靶點。本研究提示G等位基因可能與T2DM心血管發病率相關。與Chen等〔13〕研究結果一致。同時，本研究還說明HHEX(rs1111875) G等位基因的TC和LDL-C增高可能是增加心血管風險的原因。

綜上所述，SLC30A8 (rs13266634 )、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)未發現與中國東北漢族人群T2DM相關，不排除樣本量較少以及種族地區差異造成的。SLC30A8基因多態性位點rs13266634、HHEX基因多態性位點rs1111875與T2DM心血管并發癥存在一定的相關性，CDKN2A/2B基因多態性位點rs10811661與T2DM微血管并發癥存在一定的相關性，還有待于進一步研究證實。

4　參考文獻

1Sladek R，Rocheleau G，Rung J，et al.A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes〔J〕．Nature，2007; 445 (7130) : 881-5.

2Steinthorsdottir V，Thorleifsson G，Reynisdottir I，et al．A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes〔J〕．Nat Genet，2007; 39(6) : 770-5.

3Zeggini E，Weedon MN，Lindgren CM，et al．Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes〔J〕．Science，2007; 316(5829) : 1336-41.

4Scott LJ，Mohlke KL，Bonnycastle LL，et al．A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants 〔J〕．Science，2007; 316(5829) : 1341-5.

5Saxena R，Voight BF，Lyssenko V，et al．Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels〔J〕．Science，2007; 316(5829) : 1331-6.

6Wu Y，Li H，Loos RJ，et al.Common variants in CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，SLC30A8，and HHEX/IDE genes are associated with type 2 diabetes and impaired fasting glucose in a chinese han population〔J〕．Diabetes，2008; 57(10) : 2834-42.

7Ng MC，Tam CH，Lam VK，et al．Replication and identification of novel variants at TCF7L2 associated with type 2 diabetes in Hong Kong Chinese 〔J〕．J Clin Endocrinol Metab，2007; 92(9) : 3733-7.

8Chang YC，Chang TJ，Jiang YD，et al．Association study of the genetic polymorphisms of the transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene and type 2 diabetes in the Chinese population〔J〕．Diabetes，2007; 56(10) : 2631-7.

9Xu M，Bi Y，Xu Y，et al．Combined effects of 19 common variations on type 2 diabetes in Chinese: results from two community-based studies〔J〕．PLoS One，2010; 5(11) : e14022.

10Chimienti F，Devergnas S，Pattou F，et al．In vivo expression and functional characterization of the zinc transporter ZnT8 in glucose-induced insulin secretion〔J〕．J Cell Sci，2006; 119(20) : 4199-206.

11Ingelsson E，Langenberg C，Hivert MF，et al．Detailed physiologic characterization reveals diverse mechanisms for novel genetic loci regulating glucose and insulin metabolism in humans〔J〕．Diabetes，2010; 59(5) : 1266-75.

12Sattar N.Revisiting the links between glycaemia，diabetes and cardiovascular disease〔J〕．Diabetologia，2013; 56(4) : 686-95.

13Chen G，Xu Y，Lin Y，et al.Association study of genetic variants of 17 diabetes-related genes/loci and cardiovascular risk and diabetic nephropathy in the Chinese She population.〔J〕．J Diabetes，2013; 5(2) : 136-45.

〔2015-03-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

·心腦血管及代謝性疾病·

通訊作者:劉桂鋒(1980-)，男，博士，主治醫師，主要從事疾病影像學診斷研究。

〔中圖分類號〕R589.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4201-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.040