腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究

方呈祥,孫海燕,黃　強(qiáng)

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院 a.腫瘤科， b.放射科， c.肝膽外科，湖北 恩施 445000)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究

方呈祥a,孫海燕b,黃強(qiáng)c※

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院 a.腫瘤科， b.放射科， c.肝膽外科，湖北 恩施 445000)

1995年，Wiley等[1]從人心肌DNA和外周血液淋巴細(xì)胞中分離獲得了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)。TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是近年來治療惡性腫瘤的研究熱點(diǎn)，目前尚無藥品問世，但實(shí)驗(yàn)階段的研究已經(jīng)證實(shí)了其不同形式的化合物結(jié)構(gòu)所具有的抗腫瘤效果卓越。非小細(xì)胞肺癌作為一種人類重要的疾患，鮮有實(shí)驗(yàn)報(bào)道重組人TRAIL (reorganization human TRAIL,rhTRAIL)對(duì)其的作用[2]。本研究對(duì)rhTRAIL誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌腫小鼠瘤細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察，以期為該類藥品的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)室資料。現(xiàn)將觀察結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源小鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為我實(shí)驗(yàn)室保存，已經(jīng)過鑒定。小鼠雌雄各15只，日齡為45～60 d，平均體質(zhì)量(13.3±2.5) g，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXY(寧)2005-0001。小鼠均體型小，成熟早，性情溫順。

1.1.2試劑試藥酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20080710)、干擾素α(interferon α，IFN-α)(生產(chǎn)批號(hào)：20020040)、TNF-α(生產(chǎn)批號(hào)：20140513)等均購(gòu)于上海華大基因公司。

1.1.3儀器設(shè)備流式細(xì)胞儀(型號(hào)： FACSCalibur,廠家：美國(guó) Becton Dicknson公司)，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司,型號(hào)：sk631)。

1.2方法

1.2.1非小細(xì)胞癌細(xì)胞株Tc-1培養(yǎng)用添加雙抗的10%FBS DMEM培養(yǎng)液在5%二氧化碳飽和下37 ℃培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況后收集細(xì)胞備用，細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/L。

1.2.2小鼠接種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞將經(jīng)過培養(yǎng)的Tc-1細(xì)胞按照1 mL/只接種體積接種于小鼠右上肢皮下，30只小鼠均接種，接種后的小鼠室溫下自由采食和飲水飼養(yǎng)。

1.2.3非小細(xì)胞肺癌小鼠分組小鼠生長(zhǎng)5 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，分別標(biāo)記為：空白對(duì)照組(磷酸鹽溶液)、不同劑量的rhTRAIL陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組(分別為1、2、4、5及10 mg/kg)。使6組小鼠在體質(zhì)量、性別比例方面具有可比性。

1.2.4給藥方法陽(yáng)性對(duì)照組按照既定的給藥劑量每天皮下注射rhTRAIL溶液，空白對(duì)照組每日皮下注射對(duì)應(yīng)體積的磷酸鹽溶液，各組均連續(xù)注射15 d。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1腫瘤體積連續(xù)給藥15 d后，對(duì)上述30只小鼠采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)最短直徑，計(jì)算腫瘤的體積。

1.3.2測(cè)定小鼠TNF-α、IFN-α水平測(cè)量腫瘤體積后處死小鼠，取小鼠脾臟，將每孔濃度為2×106的脾臟細(xì)胞于96孔圓底板中培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液離心，收取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒對(duì)培養(yǎng)液TNF-α、IFN-α水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3腫瘤細(xì)胞凋亡率將上述離心的沉淀物用0.01 mol PBS溶液洗板后加入酸性磷酸酶底物檢測(cè)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)120 min，將0.1 mol濃度的氫氧化鈉溶液加入每孔中，5 min后，采用酶標(biāo)儀對(duì)各孔測(cè)定吸光度，測(cè)量波長(zhǎng)為405 nm。腫瘤細(xì)胞凋亡率=(1-100×陽(yáng)性對(duì)照不同濃度組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%。

2結(jié)果

2.1各組非小細(xì)胞肺癌小鼠腫瘤體積比較與空白對(duì)照組相比，5組陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積均值明顯小于空白對(duì)照組腫瘤體積，且隨著rhTRAIL濃度的增加，腫瘤體積減小的明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組非小細(xì)胞肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較5組陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組小鼠的Tc-1細(xì)胞凋亡率隨著rhTRAIL濃度增高，其凋亡率逐漸升高，濃度10 mg/kg高于濃度5 mg/kg，以此類推，凋亡率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3各組非小細(xì)胞肺癌小鼠TNF-α、IFN-α水平比較5組陽(yáng)性組小鼠的TNF-α、IFN-α水平均明顯高于空白對(duì)照組，濃度10 mg/kg高于濃度5 mg/kg，以此類推，TNF-α、IFN-α水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1各組小鼠腫瘤體積比較

濃度只數(shù)體積0mg/kg6532±22 1mg/kg6446±17a2mg/kg6378±15a4mg/kg6333±14a5mg/kg6270±13a10mg/kg6222±11aF13.743P<0.05

a與0 mg/kg 比較，P<0.05

表2　各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較　±s,%)

a與0 mg/kg比較，P<0.05

濃度只數(shù)TNF-αIFN-α0mg/kg6439±20 385±20 1mg/kg6647±26a635±25a2mg/kg6769±34a780±38a4mg/kg6837±44a911±50a5mg/kg6873±46a965±47a10mg/kg6925±50a980±43aF15.34514.643P<0.05<0.05

TNF-α：腫瘤壞死因子α；IFN-α：干擾素α；a與0 mg/kg比較，P<0.05

3討論

人類細(xì)胞死亡信號(hào)系統(tǒng)中有TNF配體和相應(yīng)的TNF細(xì)胞表面受體，人們由此推斷TNF和死亡信號(hào)系統(tǒng)中相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體之間存在密切的聯(lián)系，因此，TRAIL成為了腫瘤治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)[2-3]。經(jīng)過人們數(shù)十年的實(shí)驗(yàn)研究，目前，各種TNF的不同形式在對(duì)抗腫瘤方面均取得了一定的進(jìn)展，尤其是rhTRAIL，市面已經(jīng)出現(xiàn)了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑，個(gè)別國(guó)家已經(jīng)進(jìn)展到初期的臨床藥物試驗(yàn)[4-5]。在不遠(yuǎn)的將來， TRAIL類藥物將在人類和腫瘤進(jìn)行的斗爭(zhēng)中發(fā)揮重要作用[6]。

研究表明，rhTRAIL可特異性地選擇腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡[7-8]，對(duì)正常細(xì)胞并不產(chǎn)生任何不良反應(yīng)，這更客服了傳統(tǒng)腫瘤放化療時(shí)的巨大不良反應(yīng)[9]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，因此，此類藥物在對(duì)抗腫瘤上具有廣闊的前景。

本研究結(jié)果顯示，rhTRAIL能有效控制非小細(xì)胞肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生一定的凋亡，凋亡率最高可達(dá)58.0%，平均凋亡率最高可達(dá)(46.7±6.8)%，增加其細(xì)胞分泌因子，提高該小鼠的免疫功能。在給藥劑量上，給藥濃度越高，其控制腫瘤生長(zhǎng)和提高分泌細(xì)胞因子的作用越顯著。rhTRAIL經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)可有效對(duì)抗非小細(xì)胞肺癌，但其最佳給藥劑量，尚需做進(jìn)一步的研究，完善其毒理實(shí)驗(yàn)，為后續(xù)臨床實(shí)驗(yàn)提供一定的基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)

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摘要：目的觀察腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)對(duì)非小細(xì)胞肺癌小鼠模型腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用。方法將小鼠非小細(xì)胞癌細(xì)胞株Tc-1于清潔小鼠右上肢皮下接種，共接種30只，每只接種濃度為5×106個(gè)Tc-1細(xì)胞。將上述小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組(空白對(duì)照組和五種濃度rhTRAIL陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組)，各5只?？瞻讓?duì)照組每天注射一次磷酸鹽溶液，陽(yáng)性對(duì)照組每天注射不同濃度的重組人TRAIL(rhTRAIL)溶液，各組均連續(xù)注射15 d。對(duì)上述30只小鼠每2日測(cè)量腫瘤直徑計(jì)算腫瘤長(zhǎng)短直徑，計(jì)算腫瘤體積。取小鼠脾臟細(xì)胞測(cè)定腫瘤壞死因子(TNF)α、干擾素(IFN)α水平。比較上述6組小鼠腫瘤體積、抑瘤率以及TNF-α、IFN-α水平。結(jié)果五組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腫瘤體積明顯低于空白對(duì)照組[(446±17) mm3，(378±15) mm3，(333±14) mm3，(270±13) mm3，(222±11) mm3比(532±22) mm3，P<0.05]；5組陽(yáng)性對(duì)照組隨著rhTRAIL濃度的增加，腫瘤體積相應(yīng)減?。晃褰M陽(yáng)性組小鼠的Tc-1細(xì)胞凋亡率隨著rhTRAIL濃度增高，其凋亡率逐漸升高；5組陽(yáng)性組小鼠的TNF-α、IFN-α水平均明顯高于空白對(duì)照組[(647±26) ng/L、(769±34) ng/L、(837±44) ng/L、(873±46) ng/L、(925±50) ng/L比(439±20) ng/L，P<0.05;(635±25) ng/L、(780±38) ng/L、(911±50) ng/L、(965±47) ng/L、(980±43) ng/L比(385±20) ng/L，P<0.05]。結(jié)論rhTRAIL能有效增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌小鼠體內(nèi)的分泌細(xì)胞因子，有效誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌小鼠的腫瘤細(xì)胞凋亡，說明rhTRAIL對(duì)非小細(xì)胞肺癌小鼠的腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；非小細(xì)胞肺癌小鼠；誘導(dǎo)；腫瘤細(xì)胞凋亡

Experimental Study of Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand Inducing Non-small Cell Lung Cancer Cell ApoptosisFANGCheng-xianga,SUNHai-yanb,HUANGQiangc.(a.DepartmentofOncology,b.DepartmentofRadiology,c.DepartmentofHepatobiliarySurgery,UniversityHospitalofHubeiUniversityforNationalites,Enshi445000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the tumor cell inducing effect of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in non-small cell lung cancer mouse models.MethodsNon-small cell carcinoma cell line Tc-1 were inoculated subcutaneously in the right upper limb of 30 mice,5×106Tc-1 cells each inoculum.The above mice were randomly divided into six groups(control group,and rhTRAIL positive groups of five concentrations),five in each group.The blank control group was injected phosphate solution once every day,the positive control groups were injected rhTRAIL solution of different concentrations continuously for 15 d. Tumor diameter of the above mice were measured and recorded every 2 d,and the tumor volumes were calculated.Tumor necrosis factor α (TNF-α),interferon α(IFN-α) concentrations from the spleen cells of the mice were measured.The tumor volume,tumor inhibition rate,and TNF-α,IFN-α concentrations of the six groups were compared.ResultsThe tumor volume of the five positive groups were statistically significantly lower than the blank control group [(446±17) mm3,(378±15) mm3,(333±14) mm3,(270±13) mm3,(222±11) mm3vs (532±22) mm3,P<0.05];with the increase of rhTRAIL concentration,the tumor volume of the five positive groups reduced accordingly;Tc 1 cell apoptosis rate in mice increased with the increase of rhTRAIL concentration; TNF-α,IFN-α concentration in mice of the five positive groups were significantly higher than the blank control group[(647±26) ng/L,(769±34) ng/L, (837±44) ng/L,(873±46) ng/L,(925±50) ng/L vs (439±20) ng/L,P<0.05;(635±25) ng/L,(780±38)ng/L,(911±50) ng/L,(965±47) ng/L,(980±43) ng/L vs (385±20) ng/L,P<0.05].ConclusionrhTRAIL can effectively enhance cytokines secretion of the non-small cell lung cancer in mice,induce apoptosis of the tumor cells,indicating rhTRAIL has a certain inhibitory effect for non-small cell lung cancer cells in mice.

Key words:Recombinant tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; Non-small cell lung cancer in mice; Induction; Tumor cell apoptosis

收稿日期：2014-11-28修回日期：2015-04-29編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.063

中圖分類號(hào):R979.1； Q279

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)16-3050-03