左旋薄荷酮抗抑郁作用及機制研究

薛勁松，李鴻雁，傅 強，馬世平

中國藥科大學中藥藥理教研室，南京 210009

左旋薄荷酮抗抑郁作用及機制研究

薛勁松，李鴻雁，傅 強*，馬世平*

中國藥科大學中藥藥理教研室，南京 210009

目的：研究左旋薄荷酮（MTN）的抗抑郁作用及可能機制。方法：以開野實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、糖水偏好實驗對ICR小鼠進行行為學觀察，探討左旋薄荷酮對抑郁模型小鼠行為學的改善作用，同時檢測小鼠血清皮質酮及皮質中糖皮質激素受體（GR）、腦源性神經營養因子（BDNF）含量的變化。結果：左旋薄荷酮15、30 mg·kg-1能顯著縮短小鼠強迫游泳、懸尾不動時間，顯著提高慢性不可預知溫和刺激（CUMS）小鼠糖水偏好值，并能顯著降低CUMS小鼠血清皮質酮含量、升高GR mRNA和BDNF的表達。結論：左旋薄荷酮具有抗抑郁作用，其抗抑郁機制可能與抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）過度活化、促進皮質BDNF的表達有關。

左旋薄荷酮；慢性不可預知溫和刺激；GR；皮質酮；BDNF

抑郁癥是一種應激相關的情感障礙，給病人帶來痛苦，同時給社會帶來了很大的經濟負擔[1]。薄荷為唇形科草本植物薄荷的地上部分，辛、涼，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清熱利咽、祛風透疹、疏肝解郁的功效。左旋薄荷酮廣泛存在于薄荷揮發油中，有研究表明左旋薄荷酮具有清涼、鎮痛、止癢的功效[2]。本實驗通過急性實驗模型初步證實左旋薄荷酮可能具有抗抑郁功效，運用糖水偏好觀察左旋薄荷酮對CUMS小鼠興趣缺失的改善作用，并進一步檢測其對CUMS小鼠血清皮質酮、皮質GR mRNA以及BDNF表達的影響。

1 材 料

1.1 儀器

酶標儀（Thermo）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；冷凍離心機（Sigma公司）；CFX Con-nentTMReal-Time PCR檢測系統。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氟西?。‵LU）（常州四藥制藥有限公司，批號:20130701)；左旋薄荷酮（97%，上海將來制藥有限公司，批號：J140320001）；MaxVisionTMHRP-Polymer IHC試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；兔抗鼠BDNF多克隆抗體（CST公司）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；RNA提取試劑、HiScript誖Q RT SuperMix for qPCR（南京諾維贊生物科技有限公司）。

1.3 動物

清潔級雄性ICR小鼠由揚州大學比較醫學中心提供，生產許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，體重18～22 g，動物自由飲水、飲食，分籠飼養，室溫（25± 1）℃，保持正常晝夜節律。

2 方 法

2.1 急性實驗

2.1.1 分組與給藥 40只ICR小鼠隨機分為四組，每組10只，分別為空白對照組、陽性藥FLU組（10 mg·kg-1），MTN低、高劑量組（15、30 mg·kg-1），按0．1 mL/10 g灌胃1次/天，連續給藥7 d。

2.1.2 開野實驗 末次給藥1 h后，將小鼠置于開野設備中，適應2 min后，記錄小鼠在隨后4 min內的水平穿格次數和站立次數。

2.1.3 強迫游泳實驗 于末次給藥1 h后，將小鼠放入玻璃器皿（高20 cm，直徑14 cm）中，水深10 cm，水溫保持25℃，適應2 min后，記錄后4 min的不動時間，不動狀態以小鼠漂浮于水面靜止不動或只作輕微動作保持呼吸作為評判標準。

2.1.4 懸尾實驗 末次給藥1 h后，在距尾尖1 cm處用膠帶將小鼠懸掛于懸尾裝置中，觀察6 min，并記錄后4 min小鼠不動時間。

2.2 慢性不可預知溫和刺激

2.2.1 分組與給藥 50只ICR隨機分為5組，分別為空白對照組、模型組、陽性藥FLU組（10 mg·kg-1），MTN低、高劑量組（15、30 mg·kg-1），每天給藥一次，給藥體積為0．1 mL/10 g，小鼠適應一周后開始造模。

2.2.2 模型建立 參照文獻方法[3]建立模型?？瞻讓φ战M小鼠不給予任何刺激，其他組小鼠給予每天隨機選取2～3種刺激，造模6周。實驗刺激因子包括：禁食（24 h）、禁水（24 h）、噪音刺激（5 min）、搖晃鼠籠（5 min）、晝夜顛倒、傾斜鼠籠（45°，12 h）、夾尾（距離尾根部1 cm處夾1 min）、潮濕墊料、異物刺激。

2.2.3 糖水偏好實驗 小鼠禁食禁水24 h，每籠給予兩瓶溶液：1瓶純水，1瓶蔗糖水（1%，w/v），檢測12 h內純水和糖水消耗量。實驗中，為避免小鼠習慣性的飲用一個位置水瓶對實驗的干擾，6 h后交換2個水瓶的位置。實驗分別在第1周、第4周和第7周測定糖水偏好值，其計算公式：糖水偏好值=（糖水消耗量/總消耗量）×100%。

2.3 生化指標的測定

2.3.1 血清皮質酮的檢測 6周慢性實驗后，小鼠取血參考文獻[4]的方法進行皮質酮的檢測。取小鼠血清0．2 mL，加入0．2 mL 0．04 mol·L-1NaOH溶液，同時加入2 mL二氯甲烷震蕩分層，二氯甲烷層中加入1 mL發光液（濃硫酸∶無水乙醇，7∶3），靜置30 min后，棄去二氯甲烷層，呈色液測定熒光值。選定的測定條件：λex=470 nm，λem=525 nm。通過同樣的方法繪制標準曲線，計算樣品皮質酮的含量。

2.3.2 RT-PCR檢測皮質中GR mRNA的表達

小鼠麻醉后，斷頭取腦并分離出皮質。Trizol試劑提取總 RNA，參照 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒逆轉錄為cDNA，并參照HiScript誖Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書進行PCR擴增。GR上游引物序列：5′-AGCTCCC-CCTGGTAGAGAC-3′，下游引物序列：5′-GGTGAA-GACGCAGAAACCTT-3′；β-actin，上游引物序列：5′-TCT GGC ACC ACA CCT TCT A-3′；下游引物序列：5′-AGG CAT ACA GGG ACA GCA C-3′。

2.3.3 免疫組化測定皮質中BDNF的表達 各組小鼠以水合氯醛麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，左心室插管并剪開右心耳，灌注PBS溶液洗去血液，再灌注4%多聚甲醛進行固定，取腦，組織脫水制成蠟塊。腦切片以羊血清封閉，加入50 μL的BDNF抗體孵育37 min，PBS清洗并按試劑盒說明加入試劑，最后用二氨基聯苯胺（DAB）染色。通過Image-Pro Plus（IPP 6．0）軟件測定光密度（OD）值。

2.4 統計學處理

3 結 果

3.1 MTN對小鼠開野實驗的影響

實驗結果見表1，給藥7 d后，與空白對照組相比，FLU組及MTN低、高劑量組的小鼠穿格次數和站立次數均無顯著變化。表明該藥對小鼠自主活動無明顯影響。

表1 MTN對急性實驗小鼠開野的影響（±s，n=10）

表1 MTN對急性實驗小鼠開野的影響（±s，n=10）

組別劑量/mg·kg-1交叉次數站立次數空白對照組-72．8±16．16 20．2±4．64 FLU組10 73．7±16．80 21．2±5．35 MTN組 低15 75．8±21．08 20．1±6．23高30 74．1±15．77 22．4±7．01

3.2 MTN對小鼠強迫游泳的影響

實驗結果見圖1，與空白對照組比較，FLU組和MTN各劑量組均能縮短小鼠強迫游泳的不動時間（P＜0．05或P＜0．01）。

圖1 MTN對小鼠強迫游泳實驗不動時間的影響（±s，n=10）

3.3 MTN對小鼠懸尾的影響

實驗結果見圖2，經過7 d給藥后，與空白對照組比較，FLU組和MTN各劑量組均能縮短小鼠在懸尾實驗中的不動時間（P＜0．05或P＜0．01）。

3.4 MTN對CUMS小鼠糖水偏好的影響

如圖3所示，經過6周的慢性不可預知溫和刺激后，模型（CUMS）組小鼠與空白對照組相比，糖水偏好值顯著下降（P＜0．001），而與模型組比較，MTN低、高劑量組可顯著提高小鼠糖水攝入量（P＜0．05）。實驗結果表明MTN可改善CUMS的抑郁癥的核心癥狀：快感缺失。其具有一定的抗抑郁作用。

3.5 MTN對CUMS小鼠血清皮質酮含量的影響

CUMS小鼠的血清皮質酮與空白對照組相比明顯升高（P＜0．001)，FLU和MTN（15、30 mg·kg-1）均能顯著降低CUMS小鼠血清皮質酮的含量 （P＜0．05)，結果見圖4。

圖2 MTN對小鼠懸尾實驗不動時間的影響（±s，n=10）

圖3 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠糖水偏好的影響（±s，n=10）

圖4 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠血清皮質酮的影響（±s，n=10）

3.6 MTN對CUMS小鼠皮質GR mRNA表達的影響

PCR檢測小鼠皮質GR mRNA的表達結果顯示，與空白對照組相比，模型組GR mRNA的表達顯著降低（P＜0．01）；與模型組相比，FLU組和MTN低、高劑量組GR mRNA表達水平有顯著提高（P＜0．05或P＜0．01）。見圖5。

圖5 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠皮質GR mRNA表達的影響（±s，n=6）

3.7 MTN對CUMS小鼠皮質BDNF表達的影響

免疫組化結果如圖6和表2所示，模型組小鼠皮質BDNF與空白對照組比較顯著下降（P＜0．001），而MTN組（15、30 mg·kg-1）可顯著增加CUMS小鼠皮質中BDNF的表達（P＜0．01）。

圖6 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠皮質BDNF水平的影響（±s，n=6）

表2 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠皮質BDNF表達的影響（±s，n=6）

表2 MTN對慢性不可預知溫和刺激小鼠皮質BDNF表達的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，###P＜0．001；與模型組比較，**P＜0．01

組別劑量/mg·kg-1光密度值（OD）空白對照組-0．056±0．0094 CUMS組-0．031±0．0095###FLU組10 0．055±0．0156**MTN組 低15 0．046±0．0064**高30 0．047±0．0068**

4 討 論

開野實驗被用于探討藥物對動物自發活動的影響。強迫游泳和懸尾都是行為絕望模型，反映了小鼠在不可掙脫條件的行為絕望，表現為不動時間的延長，具有可靠性和預知性，用于抗抑郁藥的篩選。本實驗中MTN能夠明顯降低行為絕望模型小鼠的不動時間，表明其對抑郁行為有一定的改善作用。

慢性不可預知溫和刺激是抑郁癥的經典模型，該模型將實驗動物長期置于一系列不可預知、溫和的環境中，類似人類抑郁癥的形成過程。其模型可靠、有效，能模擬人類抑郁癥核心癥狀：快感缺失，常用于抑郁癥的藥效及機理研究[5]。本實驗中的ICR小鼠經過6周CUMS刺激后，糖水偏好值明顯降低，而給予MTN后小鼠則能改善這一快感缺失行為。

HPA軸（下丘腦-垂體-腎上腺軸）功能亢進假說是抑郁癥重要的發病機制，GR廣泛分布于皮質、海馬、下丘腦，是糖皮質激素發揮生理藥理作用的重要靶點[6]。當GR功能障礙時，HPA軸的負反饋機制受到抑制，糖皮質激素水平持續升高，最終導致抑郁癥的發生[7]。研究表明，糖皮質激素水平升高是抑郁癥的病理改變之一，而通過增加GR表達可以起到明顯的抗抑郁作用[8]。實驗結果顯示，相對于CUMS小鼠，MTN組小鼠（15、30 mg·kg-1）血清皮質酮水平顯著降低，皮質內GR mRNA表達顯著升高，這表明MTN可能通過改善CUMS小鼠HPA軸功能，達到抗抑郁的作用。

此外，GR下降引起的糖皮質激素過度升高，還會影響BDNF表達及 BDNF調控的神經發生[9]。BDNF在中樞神經系統中含量豐富，可促進多種類型神經元分化、增值、營養和成熟，其水平的降低會引起皮質的萎縮，從而引起人或實驗動物抑郁樣行為[10]。有研究發現，應激小鼠皮質BDNF含量下降，且抑郁癥患者腦內BDNF水平也顯著降低，抗抑郁藥則逆轉了這一過程[11]。在本研究中，CUMS小鼠皮質BDNF顯著降低，而給予MTN后則能緩解這種變化，結果證實調控BDNF的表達是MTN發揮抗抑郁作用的重要機制。

綜上所述，MTN具有抗抑郁作用，其作用機制可能與抑制HPA軸過度活化，增加BDNF的表達有關。

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Antidepressant-like Effects of L-Menthone in Depressed Mice and Its Possible Mechanisms

XUE Jin-song,LI Hong-yan,FU Qiang*,MA Shi-ping*
Department of Pharmacology of Chinese Materia Medica,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:To study the antidepressant-like effects of L-Menthone (MTN)on mice model of depression and the underlying mechanisms.Methods:ICR mice behavioral changes were observed in open field test(OFT),forced swimming test(FST),tail suspension test(TST)and sucrose preference test(SPT)to explore the potential antidepressant-like effects of MTN in depressed mice.Serum corticosterone(CORT), glucocorticoid receptor (GR)and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)were determined to illuminate the exact mechanisms.Results:Mice treated with MTN (15 or 30 mg·kg-1)decreased the immobility time in FST and TST compared with the control mice.Meanwhile,the MTN group significantly increased the sucrose intake versus the chronic unpredictable mild stress (CUMS)group.In comparison with the CUMS mice,the serum CORT level in the mice with long-term administration of MTN was decreased,while the cortical BDNF protein and GR mRNA were significantly increased.Conclusion:The antidepressant-like effects of MTN in depressed mice might be related to the regulation of hypothalamus-pituitary-adrenal(HPA)axis and BDNF levels.

L-Menthone;Chronic unpredictable mild stress (CUMS);Glucocorticoid receptor;Corticos-terone;Brain-derived neurotrophic factor

R965.1

A

1673-7806（2015）03-238-04

薛勁松，男，研究生 E-mail:xjs810955322@163.com

*通訊作者馬世平，男，教授，博導 E-mail:spma@cpu.edu.cn傅強，男，副教授 E-mail:fuqiang@cpu.edu.cn

2015-03-02

2015-03-30