利奈唑胺對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌生物膜的抑制與消除活性及體內外抗菌活性研究

靳 悅，陳向東，汪 輝，姜劍偉，王巖巖，范 璐，李 魁，王素霞

中國藥科大學 生命科學與技術學院微生物教研室，南京 210009

利奈唑胺對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌生物膜的抑制與消除活性及體內外抗菌活性研究

靳 悅，陳向東*，汪 輝，姜劍偉，王巖巖，范 璐，李 魁，王素霞

中國藥科大學 生命科學與技術學院微生物教研室，南京 210009

目的：系統性評價利奈唑胺對2013~2014年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）臨床分離株細菌生物膜 （BBF）的活性及體內外抗菌效果。方法：體外試驗測定最低抑菌濃度（MIC）；最低殺菌濃度（MBC）；最小抑制BBF濃度（MBIC）和最低BBF消除濃度（MBEC）；活菌計數法繪制時間-殺菌曲線（KCs）；體內試驗采用小鼠MRSA全身感染模型，尾靜脈給藥保護小鼠后測定半數有效劑量（ED50）；建立免疫低下小鼠MRSA大腿感染模型，記錄尾靜脈給藥24 h后大腿組織菌量的變化。結果：利奈唑胺對2013~2014年臨床分離的60株MRSA均敏感；對金黃色葡萄球菌BBF的MBIC值與萬古霉素相當，敏感性顯著高于阿莫西林；體內試驗中，利奈唑胺對全身感染小鼠有很好的治療效果，ED50小于萬古霉素與阿莫西林；對免疫低下MRSA大腿感染模型小鼠的保護作用也要優于萬古霉素和阿莫西林。結論：利奈唑胺對2013~2014年分離的MRSA臨床菌株體內外活性均較高，尤其對MRSA的細菌生物膜也顯示了極強的抑制作用。

利奈唑胺；最小抑制細菌生物膜濃度；最低細菌生物膜消除濃度；半數有效劑量

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resis-tant Staphylococcus aureus，MRSA）是近年來引起院內感染的主要病原菌，隨著抗生素的廣泛使用，金黃色葡萄球菌的多藥耐藥株在逐年增加[2]，其可導致復雜性的皮膚軟組織感染、重型肺炎、感染性心內膜炎及血液感染等，并且金葡菌極易形成細菌生物膜（bacterial biofilm，BBF），而BBF的產生加重了細菌的致病力與耐藥性，這就更增加了金葡菌感染的治療難度[1]。利奈唑胺屬于全合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，自2007年國內上市以來已經成為臨床上治療MRSA感染的一線藥品[2]。眾多相關研究表明，利奈唑胺對金黃色葡萄球懸浮菌敏感性較高，但對金葡菌BBF的抑制和消除活性的研究少見報道。為了系統性評價利奈唑胺對新分離的60株MRSA的MBIC和MBEC，做了一系列實驗研究，現報道如下。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

利奈唑胺注射液（Linezolid，Pfizer公司）；萬古霉素（Vancomycin，Eli Lilly Japan K．K，公司）；阿莫西林鈉（Amoxicillin，先聲藥業）；莫西沙星（Moxi-floxacin，拜耳藥業）；乳酸環丙沙星氯化鈉注射液（Ciprofloxacin，拜耳藥業）。

MH肉湯、MH瓊脂培養基和甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司）。

1.2 菌株

MRSA為2013～2014年臨床分離致病菌 （由廣東省人民醫院惠贈），共60株。質控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213，金黃色葡萄球菌ATCC43300，于中國藥科大學微生物學教研室保存。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，各150只，合格證號：SCXK（滬）2013-0016，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

2 方 法

2.1 利奈唑胺體外對MRSA懸浮菌的殺菌活性

采用CLSI推薦的瓊脂平板稀釋法。將藥物稀釋至平板濃度0．03～128 μg·mL-1，60株受試菌MR-SA菌懸液采用多點接種儀定量接種至MH平板，每點含菌105CFU，37℃恒溫培養箱中培養18～20 h，觀察結果。挑選MRSA菌株10株，分別接種含受試藥物濃度為MIC的1～32倍的MH肉湯管，菌液的終濃度為5×105CFU·mL-1，37℃恒溫培養24 h，取肉眼觀察未見細菌生長管中的培養液0．1 mL，加到MH瓊脂平板培養基中，37℃恒溫培養18 h，菌落數小于5個/皿的藥物最低濃度即為MBC。

2.2 利奈唑胺體外對MRSA的BBF抑制和消除活性

采用MH瓊脂平板法測定利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林對5株產BBF的MRSA的最小抑制BBF濃度（MBIC）和最低BBF消除濃度（MBEC）。用剛果紅實驗及結晶紫染色檢查法選取5株產BBF的MRSA，將5株產BBF的MRSA于96孔板中37℃培養24 h，棄去形成BBF的96孔板中的懸液，用PBS緩沖液洗滌，藥物分別2倍連續稀釋為1～1024 μg·mL-1的溶液，取200 μL各濃度藥物按順序加入各孔。37℃培養24 h。棄去懸液，每孔中加入250 μL PBS緩沖液，于50 Hz下超聲振蕩30 min，在每孔中取10 μL涂布于MH瓊脂平板上，37℃培養24 h。肉眼觀察與對照孔（PBS孔）一樣的最低藥物濃度即為MBIC，平板上未見細菌生長的最低藥物濃度即為MBEC[3]。

2.3 體外時間—殺菌曲線（KCs）測定

選擇敏感MRSA菌株1株，于MH肉湯培養基中加入利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林，使抗菌藥物終濃度為（2、4、8、16、32）×MIC，加入菌懸液使菌液終濃度約為5×105CFU·mL-1，37℃恒溫培養，分別于0、2、4、6、8、10、24 h取樣進行活菌計數，以時間為橫坐標，菌數對數為縱坐標繪制殺菌曲線。

2.4 利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林對全身感染模型小鼠的治療

挑取MRSA菌落接種于MH肉湯中，37℃、150r· min-1振蕩培養8～10 h，4℃離心10 min棄上清液，無菌生理鹽水重懸菌體。用5%的胃膜素[4]溶液將試驗菌懸液稀釋成一系列濃度，通過腹腔注射感染小鼠每只0．5 mL構建全身感染模型，測出試驗菌株的最小致死量（MLD）。將利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林分設5個劑量組及MLD空白對照組（不給藥），劑量組小鼠在MLD菌液濃度下感染后，即刻與6 h后分別尾靜脈注射給藥，0．2 mL/鼠。給藥后連續觀察7 d，每天記錄小鼠存活只數，計算利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林對試驗菌株的ED50及95%可信區間。

2.5 利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林對大腿感染免疫低下小鼠的治療

試驗前1 d、4 d分別給予小鼠腹腔注射環磷酰胺生理鹽水溶液100 mg·kg-1和150 mg·kg-1，注射量為0．2 mL，制備免疫低下模型小鼠。空白對照組在相應的時間，腹腔注射同體積的生理鹽水。最后一次注射環磷酰胺后1 d，將試驗菌MRSA稀釋成系列濃度，免疫低下小鼠分為A、B、C、D 4組，于各組小鼠雙側大腿處分別接種原菌液，10倍、100倍、1000倍稀釋菌液，每側0．1 mL，空白對照組小鼠接種等量100倍稀釋菌液。于接種2 h后，取各感染組及空白對照組小鼠2只處死，于無菌操作臺中分離雙側大腿肌肉，稱重、勻漿，進行活菌計數，37℃恒溫培養12～18 h。大腿肌肉感染26 h后，將剩余小鼠全部處死，取大腿組織稱重、勻漿，用甘露醇氯化鈉培養基進行活菌計數，測出感染菌量[4]。將利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林分為高（40 mg·kg-1）、中（20 mg· kg-1）和低（5 mg·kg-1）三個劑量組及陰性對照組，在小鼠兩側大腿感染MRSA 2 h和8 h后，劑量組尾靜脈注射不同濃度的各組藥物0．2 mL/只，對照組給予相同體積的生理鹽水，給藥24 h后將小鼠全部處死，于無菌操作臺中取各大腿肌肉組織稱重、勻漿，進行活菌計數，采用SPSS16．0軟件進行統計分析。

3 結 果

3.1 利奈唑胺體外對MRSA懸浮菌的活性結果

MIC的測定結果如表1所示。利奈唑胺對2013～2014年廣東省人民醫院臨床分離的60株MRSA均敏感，與萬古霉素相當，顯著高于莫西沙星、阿莫西林、環丙沙星，說明利奈唑胺對多藥耐藥的MRSA仍有較高的抑菌活性，且不易與其他類型的抗菌藥物產生交叉耐藥。最低殺菌濃度MBC的測定結果如表2所示。阿莫西林的MBC90/MIC90是利奈唑胺的2倍；利奈唑胺的MBC90/MIC90為16，說明其殺菌效果不強。

表1 利奈唑胺、萬古霉素、莫西沙星、阿莫西林和環丙沙星對60株MRSA的MICR、MIC50、MIC90（mg·L-1）

3.2 利奈唑胺體外對MRSA的BBF抑制和消除活性結果

利奈唑胺對MRSA的BBF的抑制作用結果如表3所示。利奈唑胺對5株耐藥菌的MBIC范圍在2～4 mg·L-1，萬古霉素MBIC也在2～4 mg·L-1，阿莫西林MBIC顯著高于利奈唑胺。利奈唑胺MBEC在128～256 mg·L-1，MBEC是MBIC的若干倍。

表2 利奈唑胺、萬古霉素、莫西沙星對20株MRSA的MBCR、MBC90（mg·L-1）、MBC90/MIC90

表3 利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林對MRSA BBF的抑制和消除活性（mg·L-1）

3.3 體外時間-殺菌曲線（KCS）測定的結果

體外時間-殺菌曲線（KCS）的測定結果如圖1所示。利奈唑胺在5～24 h內可達到99．9%的抑菌效果，萬古霉素在8～24 h內對MRSA的抑制率達99．9%，兩藥對MRSA的時間-殺菌曲線相似，均好于阿莫西林。當利奈唑胺和萬古霉素的藥物濃度≥MBC時，抑菌的作用受濃度影響較小，說明利奈唑胺與萬古霉素均為時間依賴型藥物。

圖1 利奈唑胺（A）、萬古霉素（B）、阿莫西林（C）對MRSA的殺菌曲線

3.4 MRSA全身感染模型小鼠的治療

利奈唑胺對MRSA全身感染模型小鼠的治療效果如表4所示。利奈唑胺對全身感染模型小鼠有很強的保護作用，ED50為3．37mg/kg，優于對照藥萬古霉素5．26 mg·kg-1，阿莫西林的ED50為26．94 mg· kg-1，顯著高于利奈唑胺。

3.5 MRSA大腿感染免疫低下小鼠的治療

免疫低下小鼠大腿內側肌肉處接種菌量為6．3×105CFU，接種2 h后，將其處死，大腿肌肉勻漿菌落計數為（9．64±0．82）×105CFU·g-1。利奈唑胺各藥物濃度對大腿感染模型小鼠均有良好的治療作用，高、中、低劑量組菌落數與不給藥物治療的陰性對照組比較有極顯著性差異（P＜0．01）；隨著藥物劑量由低到高的增加，治療效果顯著加強。利奈唑胺低濃度劑量組菌落數與萬古霉素低劑量組比較差異顯著（P＜0．05），高、中劑量組菌落數兩組比較無差異性（P＞0．05）；阿莫西林中、低劑量組菌落數與陰性對照組比較無差異性（P＞0．05）。由圖2可以看出，利奈唑胺治療小鼠MRSA大腿感染模型的效果略優于萬古霉素，顯著好于阿莫西林。

表4 利奈唑胺、萬古霉素和阿莫西林對MRSA全身感染模型小鼠的ED50（mg·kg-1）

圖2 利奈唑胺、萬古霉素、阿莫西林不同藥物濃度（5、20、40 mg·kg-1）對免疫低下小鼠大腿感染模型的治療效果

4 討 論

MRSA是臨床常見的病原菌，可引起化膿性感染和院內感染，嚴重威脅著人類的健康，多藥耐藥菌株的出現和傳播為金黃色葡萄球菌的臨床治療帶來更大的難度[5]。此外，金黃色葡萄球菌易形成BBF，BBF的產生加強了細菌的致病性和耐藥性，這就更加大了治療的難度。利奈唑胺是一種全合成的噁唑烷酮類抗菌新藥，臨床上廣泛用于治療革蘭陽性菌所致的感染[6]。研究報道，利奈唑胺作用于細菌核糖體50S大亞基的肽酰位，當細菌70S起始復合物未形成時，利奈唑胺與50S大亞基結合，導致其構型改變，與30S起始復合物的親和力降低，則細菌不能形成70S起始復合物，翻譯不能正常進行。在細菌正常的70S起始復合物中，氨酰t-RNA占據著50S亞基的肽酰位，即P位點，若利奈唑胺作用于細菌50S大亞基，藥物就會占據P位點，在肽鍵形成時抑制肽鍵從A位到P位的易位,阻礙細菌蛋白質的合成。獨特的作用機制使其不易與其他類型的抗菌藥物產生交叉耐藥[7]。

本實驗中，利奈唑胺對2013～2014年臨床分離的60株多藥耐藥MRSA懸浮菌均敏感，其MIC值介于0．25～2 mg·L-1，略低于萬古霉素，顯著低于莫西沙星、阿莫西林和環丙沙星，說明利奈唑胺對多藥耐藥的金黃色葡萄球菌仍有較高的活性，且不易產生交叉耐藥。其對MRSA產生BBF的最小抑制濃度（MBIC）介于2～4 mg·L-1，與萬古霉素相當，敏感性顯著高于阿莫西林；最低BBF消除濃度（MBCE）在128～256 mg·L-1，是MBIC的若干倍。可見BBF一旦形成，則利奈唑胺也很難將其完全清除。體內試驗結果顯示，對于MRSA全身感染的小鼠，利奈唑胺ED50為3．37 mg·kg-1，明顯優于萬古霉素5．26 mg· kg-1和阿莫西林26．94 mg·kg-1。利奈唑胺尾靜脈注射給藥后對感染模型鼠顯示了較強的保護作用。

利奈唑胺在體內外均有顯著的抗MRSA活性，尤其對BBF顯示了極強的抑制作用，可作為臨床治療MRSA BBF感染的藥物，并且臨床可結合其MIC、MBC、MBIC、MBEC及殺菌曲線、ED50等參數，設計更為合理的給藥方案，以延長利奈唑胺的“使用周期”。

[1]Niederman MS,Chastre J,Solem CT,et al．Health e-conomic evaluation of patients treated for nosocomial pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus:secondary analysis of a multicenter ran-domized clinical trial of vancomycin and linezolid[J]．Clin Ther,2014,36(9):1233-43．

[2]Bhan U,Podsiad AB,Kovach MA,et al．Linezolid has unique immunomodulatory effects in post-influenza community acquired MRSA pneumonia[J]．PLoS One, 2015,10(1):e0114574．

[3]申鳳鴿．甘草查耳酮A抗金黃色葡萄球菌生物被膜的分子機制初步研究[D]．吉林大學，2013．

[4]張序磊，陳向東，高 聰，等．新截短側耳素類化合物S3對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性研究 [J]．藥物生物技術，2013，20（6）：510-3．

[5]WunderinkRG,NiedermanMS,KollefMH,etal．Linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus nosocomial pneumonia:a randomized,controlled study [J]．Clin Infect Dis,2012,54(5):621-9．

[6]Matsumoto K,Shigemi A,Takeshita A,et al．Analysis of thrombocytopenic effects and population pharmacoki-netics of linezolid:a dosage strategy according to the trough concentration target and renal function in adult patients[J]．Int J Antimicrob Agents,2014,44(3):242-7．

[7]辛小娟，黃文祥，李佳俊．利奈唑胺及其耐藥機制研究[J]．中國抗生素雜志，2013，38（6）：411-4．

Activity of Linezolid against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Biofilm and Its Antimicrobial Activity in Vitro and in Vivo

JIN Yue,CHEN Xiang-dong*,WANG Hui,JIANG Jian-wei,WANG Yan-yan,FAN Lu,LI Kui,WANG Su-xia
Department of Microbiology,School of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nan-jing 210009

Objective:To systematically research the antimicrobialactivity ofLinezolid against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)from 2013～2014 in vitro and in vivo．Methods:Minimal inhibitory concentration(MIC),minimal bactericidal concentration(MBC),minimal bacterial biofilm inhibitory concentration (MBIC)and minimal bacterial biofilm eradication concentration (MBEC)were determined in vitro．The time-killing curves (KCs)were drawn by live bacteria counting method．In vivo tests,the model of systemic infection with MRSA was established in mice,the mice were treated with linezolid by intravenous injection for the calculation of ED50．With the established immunodeficiency mouse model of thigh infection with MRSA,CFU in the thighs were counted 24 hours after the administration of linezolid by intravenous injection．Results:Linezolid was sensitive to all 60 clinically isolated MRSA．The MBIC of linezolid against MRSA bacterial biofilm were similar to those of Vancomycin,its sensitivity was significantly higher than that of Amoxicillin．In vivo,linezolid had better effects against systemic MRSA infection and thigh muscle MRSA infection compared with those ofVancomycin and Amoxicillin．Conclusion:Linezolid has excellent antibacterial activity against MRSA in vitro and in vivo．

Linezolid;Minimal bacterial biofilm inhibitory concentration;Minimal bacterial biofilm eradication concentration;Median effective dose

R915

A

1673-7806（2015）03-242-04

靳悅，女，碩士生 E-mail:njjinyue@126.com

*通訊作者陳向東，女，副教授 E-mail:chenxd_xj@163.com

2015-04-02

2015-05-12