LC-MS/MS測定人血清帕拉德福韋濃度方法的建立及在人體藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

張 燁，肖青青，申 璐，楊 勁*

中國藥科大學(xué)1藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中心；2臨床藥學(xué)教研室，南京 210009

LC-MS/MS測定人血清帕拉德福韋濃度方法的建立及在人體藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

張 燁1，肖青青2，申 璐1，楊 勁1*

中國藥科大學(xué)1藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中心；2臨床藥學(xué)教研室，南京 210009

目的：建立人血清帕拉德福韋濃度檢測方法并運(yùn)用于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。方法：血清樣品乙腈沉淀蛋白處理后，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定。以0.2 mmol·L-1乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm×2.1 mm，5 μm）分離，梯度洗脫。帕拉德福韋及內(nèi)標(biāo) （恩替卡韋）監(jiān)測離子對(duì)為m/z 424.1→151.0；m/z 278.3→152.1。運(yùn)用建立的方法測定健康受試者血清中藥物濃度。結(jié)果：帕拉德福韋血清藥物濃度在0.5~500 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法回收率、日內(nèi)及日間精密度均符合方法學(xué)要求。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于帕拉德福韋人體藥動(dòng)學(xué)研究。

帕拉德福韋；LC-MS/MS；藥代動(dòng)力學(xué)

具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗乙肝病毒Ⅰ類新藥甲磺酸帕拉德福韋——[9-[2-[2，4-順式-（S）-（+）-4-（3-氯苯基）-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)己烷-2-基]甲氧基乙基]腺嘌呤]，是口服的阿德福韋（PMEA）前藥，具有一定肝臟靶向性。它采用HepDirectTM專利技術(shù)開發(fā)，肝靶向能力源于母體藥物PMEA的碳磷酸鹽化合物的化學(xué)改性，最終形成環(huán)狀碳磷酸鹽化合物二酯衍生物。碳磷酸鹽化合物二酯在中性或酸性pH值下對(duì)水解作用穩(wěn)定。其結(jié)構(gòu)中的4-芳基取代基能被肝臟細(xì)胞色素P450同工酶3A4（CYP3A4）特異識(shí)別并催化氧化，從而釋放PMEA。后者能與脫氧腺苷三磷酸競爭或直接整合到病毒DNA中，從而抑制乙肝病毒的DNA多聚酶，引起DNA鏈延長終止，發(fā)揮抗乙肝病毒作用[1]。

目前該藥已進(jìn)入臨床研究階段，而文獻(xiàn)報(bào)道的樣品處理方法為固相萃取法[2]，耗時(shí)較長、步驟繁瑣。本文擬建立簡單高效的LC-MS/MS的帕拉德福韋血藥濃度檢測方法，并運(yùn)用該方法測定健康受試者帕拉德福韋血清濃度。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

甲磺酸帕拉德福韋（西安新通藥物研究有限公司，批號(hào)D120301，純度99.54%）；恩替卡韋（內(nèi)標(biāo)，海南中和藥業(yè)有限公司，批號(hào)20081001，純度100.2%）。

乙腈為色譜純（Merk公司）；乙酸銨（西隴化工股份有限公司，批號(hào)130916；純度≥98%）；超純水。

1.2 儀器

Sartorius BT25S電子天平 （賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；H-101型多功能漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；芬蘭單道移液器（Thermo Electron公司，美國）；Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī) （Sigma公司，德國）；API3000液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，含：自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣系統(tǒng)、柱溫箱、二元梯度泵、電噴霧離子化接口、三重四極桿質(zhì)譜檢測器、色譜工作站（Analyst 1.4.2）、Analyst 1.4.2定量處理軟件（Ap-plied Biosystems公司，美國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.1.1 帕拉德福韋對(duì)照品溶液 精密稱取甲磺酸帕拉德福韋12.3 mg（經(jīng)物質(zhì)的量和純度換算，相當(dāng)于含帕拉德福韋10.0 mg）于10 mL棕色量瓶中，超純水溶解并稀釋至刻度，即得1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?chǔ)備液逐級(jí)用超純水∶甲醇 （1∶1，v/v）稀釋，配制為含帕拉德福韋為5、2、1μg·mL-1，500、200、100、50、20、10、5 ng·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 恩替卡韋對(duì)照品溶液 精密稱取恩替卡韋10．0 mg于10 mL量瓶中，加入甲醇∶水（1:1，v∶v）溶解并稀釋至刻度，即得1 mg·mL-1恩替卡韋儲(chǔ)備液；取儲(chǔ)備液適量加入超純水∶甲醇（1∶1，v/v）稀釋，配成1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中保存待用。

2.2 色譜、質(zhì)譜條件

Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm× 2．1 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0．2 mmol·L-1乙酸銨水溶液 （A）-乙腈 （B）（梯度洗脫程序：0～1．0 min，10%B；1．0～2．0 min，由10%B變至85%B；2．0～3．5 min，85%B；3．5～6．5 min，由85%B變至10%B）；流速：0．3 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃；進(jìn)樣量：5 μL。

電噴霧電離源（ESI源），掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子模式；源噴射電壓（IS）：5500 V；碰撞氣壓（CAD）：27．58 kPa；門簾氣壓（CUR）：68．95 kPa；霧化氣壓（NEB）：82．74 kPa；離子碎片檢測信號(hào)：帕拉德福韋m/z 424．1→151．0；內(nèi)標(biāo)（恩替卡韋）m/z 278．3→152．1。帕拉德福韋質(zhì)譜參數(shù)為DP：47 V；EP：10 V；CE：36 V；CXP：10 V。恩替卡韋（內(nèi)標(biāo)）質(zhì)譜參數(shù)為DP：40 V；EP：10 V；CE：27 V；CXP：10 V。1．1 min切入質(zhì)譜，3．4 min切出質(zhì)譜，共采集2．3 min。質(zhì)譜分析圖見圖1。

圖1 質(zhì)譜特征離子圖

2.3 血清樣品前處理方法

于1．5 mL EP管中精密加入血清樣品100 μL，加入300 μL含內(nèi)標(biāo)的乙腈 （內(nèi)標(biāo)濃度30 ng·mL-1）沉淀蛋白，渦旋2 min，12000 r·min-1離心6 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行LC-MS/MS分析，進(jìn)樣量5 μL。

3 方法學(xué)驗(yàn)證及結(jié)果

3.1 專屬性考察

取6份不同來源空白人血清，考察檢測方法的特異性，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)LC-MS/MS條件下，帕拉德福韋出峰時(shí)間在2．83 min左右；內(nèi)標(biāo)(恩替卡韋)出峰時(shí)間在1．43 min左右；峰形良好，在出峰位置無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)。空白血清、空白血清+待測物+內(nèi)標(biāo)的血清樣品色譜圖見圖2。

圖2 典型色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

取1．5 mL EP管數(shù)支，分別加入不同濃度的帕拉德福韋標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，40℃下氮?dú)鈸]干，加入空白血清100 μL，旋渦混勻，配制成含有帕拉德福韋0．5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列樣品，按“2．3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣，記錄色譜圖，以待測物的濃度為橫坐標(biāo)，待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行權(quán)重回歸計(jì)算，得到回歸方程：f=0．0554c+0．00413，r=0．9996，權(quán)重系數(shù)w=1/c。結(jié)果表明，藥物濃度在0．5～500 ng· mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

定量下限（LLOQ）為0．5 ng·mL-1，信噪比大于10，連續(xù)測定6份LLOQ樣品準(zhǔn)確度為94．23%，RSD為5．82%。

3.3 精密度及準(zhǔn)確度

制備帕拉德福韋濃度分別為1、8、80、400 ng· mL-1的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測定3天，按“2．3”項(xiàng)下方法操作，將待測物濃度和待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值代入當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的測得濃度，并以QC樣品結(jié)果計(jì)算準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表1。本法的準(zhǔn)確度與精密度符合生物樣品分析要求。

3.4 穩(wěn)定性考察

制備帕拉德福韋濃度分別為1、8、80、400 ng· mL-1的質(zhì)量控制（QC）樣品，每一濃度平行配制3份，共配制4批。1批按“2．3”項(xiàng)下方法操作，立即處理并進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄色譜圖；將即刻穩(wěn)定性的樣品在測定完成后，于進(jìn)樣架中放置24 h后再次進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；1批于室溫下冰浴放置4 h后，按“2．3”項(xiàng)下方法操作并立即進(jìn)行LC-MS/ MS分析，記錄色譜圖；1批在-80℃冰箱反復(fù)凍融3次后按“2．3”項(xiàng)下方法操作并立即進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄色譜圖；1批于-80℃冰箱放置94 d后，按“2．3”項(xiàng)下方法操作并立即進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄色譜圖；分別計(jì)算帕拉德福韋峰面積As、內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），將該比值代入當(dāng)批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算實(shí)測濃度和百分偏差，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，帕拉德福韋血清樣品即刻、反復(fù)凍融3次、在進(jìn)樣架放置24 h、室溫下冰浴放置4 h以及-80℃冷凍94 d的條件下穩(wěn)定性良好。

表1 LC-MS/MS法測定帕拉德福韋的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

表2 帕拉德福韋血清樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果（n=3）

3.5 提取回收率

本實(shí)驗(yàn)考察了帕拉德福韋4個(gè)濃度，即1、8、80、400 ng·mL-1下的提取回收率。以經(jīng)過提取所得的待測物色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣所得的待測物色譜圖峰面積之比，來考察樣品的提取回收率，每濃度進(jìn)行5樣本分析，結(jié)果見表1。帕拉德福韋在以上4個(gè)濃度的提取回收率分別為 （115．18± 14．81）%、（98．66±8．82）% 、（107．34±6．81）% 及（108．10±6．98）%，不同濃度水平的帕拉德福韋提取回收率RSD＜15%，表明該方法提取回收率較穩(wěn)定。

3.6 基質(zhì)效應(yīng)

考察不可見成分干擾對(duì)待測藥物帕拉德福韋離子化效率的影響情況。取不同志愿者空白血清，按“2．3”項(xiàng)下方法操作后加入不同濃度帕拉德福韋標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行LC-MS/MS分析獲得峰面積，與相同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣獲得峰面積比較，評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。不同濃度帕拉德福韋基質(zhì)效應(yīng)為74．83%～80．70%，6批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的RSD＜10．88%。血清中的共流出成分對(duì)帕拉德福韋的離子化效率產(chǎn)生一定抑制作用，不同濃度水平抑制效率在同一水平上。

3.7 殘留效應(yīng)

以定量上限 （ULOQ）500 ng·mL-1進(jìn)行LC-MS/ MS分析后隨即進(jìn)樣空白血清提取物，重復(fù)3次考察方法的殘留效應(yīng)，結(jié)果表明，在ULOQ進(jìn)樣后再進(jìn)空白血清提取物，在待測物出峰位置無響應(yīng)，表明該方法殘留效應(yīng)符合要求。

4 建立的方法在人體藥動(dòng)學(xué)研究中應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)建立的方法成功地運(yùn)用于甲磺酸帕拉德福韋臨床劑量爬坡試驗(yàn)（10～120 mg）的血清藥物濃度的測定。一切按規(guī)范要求處理。根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)選擇健康受試者，男女各半，試驗(yàn)前簽署知情同意書。受試者空腹過夜后次日早上7點(diǎn)溫開水送服10、30、60、90 mg或120 mg甲磺酸帕拉德福韋片，并在服藥后繼續(xù)空腹4 h。早中晚餐統(tǒng)一進(jìn)食。給藥后 0 h、15、30、45 min，1、1．5、2、3、4、6、8、12、16、24、36、48、72、96、120 h采集血清樣品。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法測定血清藥物濃度，最低劑量組（10 mg）和最高劑量組（120 mg）平均藥-時(shí)曲線見圖3。

5 討 論

本實(shí)驗(yàn)采取蛋白沉淀的樣品前處理方法，與已有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測方法相比[2]，操作簡單、快捷。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與甲醇相比，乙腈能更好地使待測物與蛋白質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)分離，并且3倍體積的沉淀劑可起到稀釋基質(zhì)作用，進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)待測物響應(yīng)的影響。但是，直接蛋白沉淀對(duì)生物樣品中強(qiáng)極性基質(zhì)去除效果不佳。因此，需要在色譜洗脫時(shí)將待測物與生物樣品中的強(qiáng)極性基質(zhì)分離。Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm×2．1 mm，5 μm）對(duì)強(qiáng)極性基質(zhì)保留較弱，通過調(diào)節(jié)優(yōu)化流動(dòng)相洗脫梯度，延后待測物出峰時(shí)間，使待測物與內(nèi)源性組分在色譜柱中差速分離，以此避免基質(zhì)效應(yīng)引起的響應(yīng)抑制和響應(yīng)波動(dòng)[3]。另外，利用閥切換功能，將先從色譜柱中流出的內(nèi)源性基質(zhì)切出質(zhì)譜，從而避免了大量基質(zhì)聚集于電噴霧口與待測物在霧滴表面離子化的過程中產(chǎn)生競爭導(dǎo)致待測物離子化效率降低[4]。

圖3 健康受試者單劑量口服10 mg或120 mg甲磺酸帕拉德福韋后藥時(shí)曲線（n=6）

為了滿足甲磺酸帕拉德福韋臨床劑量爬坡試驗(yàn)的需求，本實(shí)驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性范圍為0．5～500 ng·mL-1。由于線性范圍較寬，為避免殘留效應(yīng)的產(chǎn)生，采取了增加洗針次數(shù)為4次，即進(jìn)樣前洗針2次，進(jìn)樣后洗針2次。經(jīng)方法驗(yàn)證，增加洗針次數(shù)能有效消除殘留效應(yīng)。

[1]Erion MD,Reddy KR,Boyer SH,et al．Design,syn-thesis,and characterization of a series of cytochrome P (450)3A-activated prodrugs(HepDirect prodrugs)useful for targeting phosph(on)ate-based drugs to the liver[J]．J Am Chem Soc,2004,126(16):5154-63．

[2]Lin CC,Xu C,Teng A,et al．Pharmacokinetics of pradefovir and PMEA in healthy volunteers after oral dosing of pradefovir[J]．J Clin Pharmacol,2005,45(11): 1250-8．

[3]Bennett PK,Horne KV．Identification of the major en-dogenous and persistent compounds in plasma,serum, and tissue that cause matrix effects with electrospray LC/MS techniques[C]．AAPS Conference,Salt Lake City, Utah,2003．

[4]Bonfiglio R,King RC,Olah TV,et al．The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug com-pounds[J]．Rapid Commun Mass Spectrom,1999,13 (12):1175-85．

Establishment of an LC-MS/MS Method for the Determination of Pradefovir in Human Serum and the Application in Clinical Pharmacokinetics

ZHANG Ye1,XIAO Qing-qing2,SHEN Lu1,YANG Jing1*
1Center of Drug Metabolism and Pharmacokinetics;2Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective:To set up a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric(LC/MS/MS) method for the determination of pradefovir in human serum and to apply it to the clinical pharmacokinet-ics．Methods:The serum sample was precipitated by acetonitrile，and the supernatant was analyzed by LC-MS/MS．Chromatographic separation was performed on a Thermo BDS HYPERSIL C18column(150 mm× 2．1 mm,5μm)with a gradient elution system of 0．2 mmol·L-1ammonium acetate buffer-acetonitrile at a flow-rate of 0．3 mL·min-1．The ion transitions recorded in multiple reaction monitoring mode were m/z 424．1([M+H]+)→151．0 for pradefovir and m/z 278．3([M+H]+)→152．1 for the internal standard．The estab-lished method was used to determine the serum concentration of pradefovir in healthy subjects．Results:The linear range of calibration curves for pradefovir was 0．5-500 ng·mL-1．The recovery and the intra-and inter-assay precisions met the requirements of bioanalytical methods．Conclusions:The method is proven to be rapid,specific and sensitive．It can be used for the clinical pharmacokinetic study．

Pradefovir;LC-MS/MS;Pharmacokinetics

R969.1

A

1673-7806（2015）03-263-04

張燁，女，研究生 E-mail:yeah19880927@sina.com

*通訊作者楊勁，男，副教授，碩士生導(dǎo)師 E-mail:yjcpu@yahoo.com

2015-03-28

2015-05-12