高效液相色譜法測定血中伊立替康及活性代謝物SN-38濃度

鞠曉宇，羅雪梅，葛衛紅，王友群*中國藥科大學，南京 0009；南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 0008

高效液相色譜法測定血中伊立替康及活性代謝物SN-38濃度

鞠曉宇1，羅雪梅2，葛衛紅2，王友群1*
1中國藥科大學，南京 210009；2南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 210008

目的：建立高效液相色譜法同時測定結直腸癌患者血中的伊立替康（CPT-11）及其活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）的濃度，并對我院基因型指導給藥方案進行評價。方法：以2 μg·mL-110-羥基喜樹堿作為內標，先用100 μL 10%高氯酸沉淀蛋白，再用50 μL 10%高氯酸酸化血漿。采用Agilent ZORBAX Eclipse C8色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）對CPT-11和SN-38進行分離；以0.05 mol·L-1的磷酸二氫鈉-乙腈-三乙胺（75∶25∶0.1，v∶v，磷酸調pH 3.0）為流動相；熒光檢測波長：激發波長380 nm，發射波長550 nm。結果：人血漿中CPT-11和SN-38線性范圍均為3~1000 ng·mL-1，定量下限為3 ng·mL-1；準確度分別是98.5%和100.0%；回收率分別是83.8%和84.3%。結論：本方法可靠、簡便、快速，可為伊立替康個體化給藥提供參考。

伊立替康；SN-38；血藥濃度；高效液相色譜；熒光檢測

伊立替康（irinotecan，CPT-11）是一種水溶性喜樹堿衍生物，能通過干擾DNA復制和轉錄，產生細胞毒效應[1]。臨床上，伊立替康與5-氟尿嘧啶和亞葉酸聯合治療既往未接受化療的晚期結直腸癌。

伊立替康在體內主要經羧酸酯酶代謝成活性代謝產物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）。SN-38通過肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）的糖基化作用，滅活成無活性的葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）而排出[1]。SN-38G可在腸道細菌β-葡萄糖醛酸酶作用下轉換為SN-38，引發腸黏膜損傷及遲發性腹瀉[2]。SN-38作為伊立替康的活性代謝產物，又是產生嚴重不良反應的誘導因素，因此建立一套同時測定伊立替康和SN-38的方法顯得尤為重要。目前主要的檢測手段多為高效液相色譜法（HPLC）聯用質譜法（MS），成本較高，不適宜臨床大規模推廣。本實驗以10-羥基喜樹堿作為內標，建立結直腸癌患者血中伊立替康及SN-38的HPLC法聯合熒光檢測分析方法，旨在為伊立替康個體化治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液色譜儀（美國Agilent公司，包括四元高壓泵，在線脫氣機，手動進樣器，柱溫箱，FLD熒光檢測器和1100 Agilent色譜工作站）；AUW220D型電子天平（日本島津公司）。

1.2 藥物與試劑

伊立替康對照品（批號100767-201303，中國食品藥品檢定研究院）；SN-38對照品（批號LR30O14，北京百靈威科技有限公司）；10-羥基喜樹堿（內標，批號20090701，黃石李時珍藥業集團武漢李時珍藥業有限公司）。乙腈為色譜純；磷酸二氫鈉、三乙胺、高氯酸均為分析純；水為純凈水。

1.3 受試者基因檢測

受試者為我院腫瘤科住院患者，診斷為結直腸癌。治療過程中，按照美國食品和藥品監督管理局（FDA）的建議，受試者在接受伊立替康化療前進行UGT1A1*28基因型檢測。采集2 mL患者全血于EDTA抗凝管，采用PHARM-GENE 200 SNP分析樣品處理試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司）處理，嚴格按照說明書操作分批次統一提取，采用熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）測定，讀取基因型。UGT1A1基因型分為6/6型（野生型）、6/7型（突變雜合子型）和7/7型（突變純合子型）。結合患者基因型及病情進行首劑量給藥，以減少不良反應。

首劑量給藥后，于化療結束后0 h、24 h各取3 mL靜脈血，置于EDTA抗凝取血管中，離心分離出血漿，所有測試樣品均保存于-20℃冰箱中待用。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse C8（4．6 mm× 150 mm，5 μm）（Agilent）；流動相：0．05 mol·L-1磷酸二氫鈉-乙腈-三乙胺 （75∶25∶0．1，v∶v，磷酸調pH 3．0）；熒光激發波長380 nm，發射波長550 nm；柱溫：23℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取CPT-11和SN-38對照品5．5 mg和4．7 mg，用二甲亞砜溶解并定容至10 mL量瓶中，配制成0．55 mg·mL-1和0．47 mg· mL-1的標準貯備液。精密量取標準貯備液適量，再用乙腈-水-甲酸（50∶50∶0．1）稀釋液分別逐步稀釋成含 CPT-11及 SN-38為20、6、2、0．6、0．2、0．06 μg· mL-1的標準工作液，置-20℃冰箱保存備用。

2.2.2 內標溶液 精密稱取內標10-羥基喜樹堿適量制成2 μg·mL-1的溶液，置-20℃冰箱保存備用。

2.3 血漿樣品的制備

取血漿樣品200 μL置于1．5 mL EP管中，加入2 μg·mL-1內標液10 μL，混勻，以100 μL 10%高氯酸為沉淀劑，12000 r·min-1離心3 min；取200 μL上清液，加入50μL 10%高氯酸酸化，混勻，20μL進樣。

3 結 果

3.1 方法專屬性考察

空白血漿、空白血漿加內標和標準品、受試者伊立替康注射后0 h、24 h血漿按“2．3”項下方法操作。由圖1可見內標、CPT-11和SN-38的保留時間分別為4．2、5．7、7．8 min，血漿樣品中內源性物質不干擾內標、CPT-11和SN-38的測定。

3.2 標準曲線制備

取健康人空白血漿180μL，加入CPT-11和SN-38系列濃度對照品溶液各10 μL，混勻，配制成相當于血藥濃度為1000、300、100、30、10、3 ng·mL-1的對照品血漿。按“2．3”項下方法操作。以被測物峰面積與內標峰面積的比值（Ai/As）對血漿濃度（c）作線性回歸，得CPT-11（Y1）和SN-38（Y2）標準曲線方程，分別為式（1）和式（2）。CPT-11和SN-38線性范圍均為3～1000 ng·mL-1。定量下限為3 ng·mL-1。

3.3 精密度試驗

分別制備CPT-11和SN-38濃度為800、80、8 ng·mL-1的對照品血漿，按“2．3”項下方法操作，同日和連續5 d各處理5份血漿，求得日內和日間精密度。結果見表1。低、中、高濃度時CPT-11和SN-38的精密度符合生物樣品分析的要求。

圖1 高效液相色譜圖

3.4 回收率試驗

配制并處理含CPT-11和SN-38濃度分別為800、80、8 ng·mL-1的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，按“2．3”項下依法操作，作為回收率樣品；另取5個不同來源空白血漿同法處理，取上清液，加入CPT-11、SN-38和內標標準溶液，配制同上3個質量濃度的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，作為回收率對照樣品。將上述樣品進樣，記錄色譜圖，回收率樣品峰面積與相應對照品峰面積均值之比即為回收率值，結果見表l。低、中、高濃度時，CPT-11和SN-38的回收率符合生物樣品分析的要求。

表1 方法精密度及回收率（n=5）

3.5 方法穩定性

分別考察CPT-11和SN-38濃度為800、80、8 ng·mL-1的對照品血漿穩定性：（1）3份立即處理并測定；（2）3份室溫放置6h后處理測定；（3）3份反復凍融3次后處理測定；（4）3份于進樣器放置8h測定。結果顯示，（2）、（3）、（4）組相對于 （1）組CPT-11的相對含量均大于90．0%；SN-38的相對含量均大于89．0%。穩定性良好。

3.6 樣品測定

6名患者（女2人，男4人，年齡49～53歲），均診斷為結直腸癌。6名受試者在接受伊立替康化療前均接受UGT1A1*28位點的基因型檢測，以結果指導患者首次給藥劑量。6名受試者在伊立替康注射結束后0 h、24 h時采樣，無遺漏。經測定，各患者伊立替康及SN-38血藥濃度結果見表2。

4 討 論

4.1 方法學評價

現有文獻報道顯示，血中CPT－11及其活性代謝產物SN－38的測定方法大多采用高效液相色譜法聯用質譜法[3]或超高液相色譜法[4]。本文所建立的HPLC法，檢測成本低，其檢測儀器在醫院較為普及。與同樣采用熒光檢測法檢測的文獻中方法相比[5]，本實驗通過流動相組分優化及色譜柱的選擇，在等度洗脫條件下使各組分達到了很好的分離度，且每針分析時間縮短至10 min以內。本方法特異性好，分離度高，血漿內源性物質無干擾。適用于醫院臨床樣本的快速分析，以完成伊立替康的個體化給藥的工作。

表2 6名受試者血藥濃度測定結果（ng·mL-1）

4.2 系統適應性

實驗分別對流動相的組成及比例進行了考察，當使用甲醇-磷酸二氫鈉作為流動相時，雖然待測物能夠分離，但系列溶液并不成線性。改用乙腈-磷酸二氫鈉后，不僅改善峰形，且系列溶液呈良好的線性關系，但CPT-11和內標存在一定拖尾現象；加入0．1%的三乙胺后峰型有顯著改善，見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

要注意的是，柱溫的微小變化對待測物的保留時間也有一定影響，因此在實驗過程中應該保持柱溫恒定，保證實驗的重現性。

4.3 樣品的預處理

CPT－11及其活性代謝產物SN-38是pH依賴性，在體內保持內酯和羧酸鹽兩種形式的動態平衡，當pH在4～5時，是以內酯形式存在；而當pH為7．4時，是以羧酸鹽形式占優勢[3]。實驗采用乙腈－水－0．01 mol·L-1甲酸（50∶50∶0．1，v∶v）來配制對照品溶液，不僅將CPT－11和SN－38都轉化為內酯形式，便于準確的測定，同時增加了兩者的穩定性。

在樣品預處理時，有的文獻采用了甲醇沉淀[6]、甲醇-乙腈沉淀并離心10 min[7]，而本實驗采用了強酸沉淀法來去除血漿中的蛋白質，10%的高氯酸溶液可以將90%以上的蛋白質除去，還縮短了操作時間。在離心后的上清液中加入50 μL高氯酸酸化，也是為了保持其呈酸性，使內酯-羧酸鹽平衡向內酯方向移動，確保測定的結果更加準確。

4.4 臨床應用

本實驗收納6名患者，在伊立替康化療前均接受UGT1A1*28基因位點檢測，根據基因分型調整初始劑量[8]。其中因6/7型患者代謝能力較野生型6/6型慢[9]，6號患者的初始劑量減少為200 mg。經過血藥濃度檢測后，患者血藥濃度控制較好，且未發生中性粒細胞減少和遲發性腹瀉等不良反應。

4號患者雖為野生型，但曾于“XELOX”方案中出現2級骨髓抑制和1級肝功異常，被迫調整為“FOLFIRI”（雙周模式）。由于患者肝功異常，為防止在化療過程中出現不良反應，因此在初始劑量時調整給藥劑量為200 mg。患者24 h的SN-38濃度較其他6/6型高，表明其代謝能力較正常人弱，但未發生遲發性腹瀉，且血常規與生化指標在正常值范圍內。建議在下個化療療程給藥時可維持原劑量。

5號患者基因型雖為6/6型，但在過去的化療過程中曾于 “羥基喜樹堿”腹腔灌注化療中出現2級消化道反應，1級骨髓抑制；曾于“艾力+希羅達”雙周方案中出現1級骨髓抑制。故在本次化療中將伊立替康劑量減少至100 mg。檢測結果表明，患者伊立替康和SN-38血藥濃度均正常，且中性粒細胞計數和膽紅素均在正常值范圍內。

5 總 結

UGT1A1是伊立替康代謝重要酶，該酶的基因多態性和藥物相互作用，導致伊立替康的臨床反應呈現明顯個體差異。因此，在2005年，美國食品和藥品監督管理局（FDA）在修訂伊立替康藥品說明書的同時，還要求伊立替康的包裝上注明該藥容易使UGT1A1*28基因突變純合子患者發生中性粒細胞減少，并且推薦檢測該基因型。近年來研究還發現，伊立替康及其代謝物的血藥濃度與治療后中性粒細胞減少百分比密切相關，即SN-38血藥濃度越高，中性粒細胞減少百分比越大[8，10]。伊立替康引發的遲發性腹瀉也與血液中的SN-38峰值濃度有關[11]。由此提示，在UGT1A1*28基因檢測的基礎上，結合患者具體病情，監測伊立替康及其代謝物SN-38的血藥濃度，能夠更好地制定安全有效的個體化給藥方案，指導臨床合理用藥。

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Determination of Irinotecan and Its Active Metabolite SN-38 in Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Fluorescence Detection

JU Xiao-yu1,LUO Xue-mei2,GE Wei-hong2,WANG You-qun1
1China Pharmacetical University,Nanjing 210009,China;2Nanjing Drum Tower Hospital,the Affiliated Hos-pital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China

Objective:To determine irinotecan (CPT-11)and its active metabolite 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38)in plasma of patients with colorectal cancer by high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection and to evaluate the dosage regimen by genotype information.Methods:Irinotecan and metabolites were detected in plasma.The internal standard was 2 μg·mL-110-hydroxycamp-tothecin.Protein in plasma was precipitated with 10%perchloric acid before acidification with 10%perchloric acid.Separation of the compounds was achieved using an Agilent ZORBAX Eclipse C8(4.6mm×150mm,5μm) analytical column.The elution was performed with a mobile phase of 0.05mol·L-1sodium dihydrogen phosphate solution-acetonitrile (75∶25,v∶v)containing 0.1%triethylamine.The fluorescence detector excitation and emis-sion wavelengths were set at 380 and 550 nm,respectively.Results:The linear ranges for CPT-11 and SN-38 were 3-1000ng·mL-1.The limits of quantification of CPT-11 and SN-38 were 3ng·mL-1.The average accuracy of CPT-11 and SN-38 were 98.5%and 100.0%;the average recoveries were 83.8%and 84.3%.Conclusion:This method is reliable,convenient and efficient,which can provide reference for individualized drug administration.

Irinotecan;SN-38;Plasma concentration;HPLC;Fluorescence detector

R969.1

A

1673-7806（2015）03-267-04

鞠曉宇，女，碩士生 E-mail:juxiaoyu900418@163.com

*通訊作者王友群，男，副教授 E-mail:wyqfbox@163.com

2015-04-16

2015-05-11