抗生素微生物檢定法中滴加抗生素溶液方法的研究

邰順章，王曉晶

鹽城市藥品檢驗(yàn)所，鹽城 224002

抗生素微生物檢定法中滴加抗生素溶液方法的研究

邰順章，王曉晶

鹽城市藥品檢驗(yàn)所，鹽城 224002

目的：探索一種加樣方法，用于抗生素微生物檢定法中滴加抗生素溶液。方法：根據(jù)抗生素微生物檢定法實(shí)驗(yàn)原理，通過對(duì)加樣誤差來源的分析，比較實(shí)驗(yàn)生物統(tǒng)計(jì)結(jié)果，篩選最佳滴加溶液方法。結(jié)果與結(jié)論：用微量移液器加樣，定量270 μL（以下稱本方法），其速度快、間隔時(shí)間短、加樣量準(zhǔn)確、減少實(shí)驗(yàn)誤差，生物檢定統(tǒng)計(jì)可靠性測(cè)驗(yàn)獲得較好的結(jié)果，是抗生素微生物檢定法實(shí)驗(yàn)中較好的加樣方法。

微量移液器；加樣方法；抗生素微生物檢定法；動(dòng)力學(xué)方程；可靠性測(cè)驗(yàn)

抗生素微生物檢定法系在適宜條件下，通過檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法[1]。是以抗菌活性為指標(biāo)來衡量抗生素中有效成分含量的一種方法，與臨床治療疾病的要求一致，因而更能反映抗生素的醫(yī)療價(jià)值。該方法具有靈敏度高、可靠性好、適用性廣、便于掌握等特點(diǎn)。所以抗生素微生物檢定法自20世紀(jì)40年代建立以來，一直收載于各國藥典中，成為抗生素含量測(cè)定的國際通用的經(jīng)典方法。但該方法操作步驟多，影響因素多，耐用性差，實(shí)驗(yàn)過程會(huì)帶來眾多操作誤差，新手難以掌握，測(cè)定結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)常常難以得到滿意的結(jié)果，需要從實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)加以嚴(yán)格控制[2-6]。隨著色譜法和光譜法在抗生素含量測(cè)定中的應(yīng)用，抗生素含量測(cè)定方法得到了拓展，但對(duì)由生物發(fā)酵制得的多組分抗生素，因其組分比較復(fù)雜，生物活性成分的比例不穩(wěn)定，各組分的抗菌效力不同等因素，無法由理化方法替代，故抗生素微生物檢定法至今仍然是抗生素含量測(cè)定的重要方法之一。本文對(duì)抗生素微生物檢定法之管碟法的供試液滴加方法進(jìn)行了探討，提出采用微量移液器定量（270 μL）加樣，對(duì)供試液滴加方法進(jìn)行更具體的規(guī)定，可提高該實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1 管碟法的基本原理

管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法[7]。即將含試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基均勻澆注在碟底，不銹鋼小管置于其上，向小管內(nèi)滴加抗生素溶液，抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴(kuò)散。在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)抗生素濃度高于最低抑菌濃度，細(xì)菌生長(zhǎng)就受到抑制，從而形成透明的抑菌圈，圈的邊緣處濃度恰好為抗生素最低抑菌濃度。通過測(cè)量抑菌圈的面積或直徑，經(jīng)計(jì)算得到可靠性檢驗(yàn)結(jié)果和抗生素含量。抑菌圈的形成遵循以下動(dòng)力學(xué)方程[8]。

r-抑菌圈的半徑，mm；D-擴(kuò)散系數(shù)，mm2/h；t-擴(kuò)散時(shí)間，細(xì)菌剛生長(zhǎng)到顯示抑菌圈時(shí)間，h；M-抗生素在小鋼管中的量，U或μg；H-培養(yǎng)基的厚度，mm；C′-最低抑菌濃度，U/mm3。

從動(dòng)力學(xué)方程可以看出，抑菌圈的大小受擴(kuò)散系數(shù)、擴(kuò)散時(shí)間、抗生素的總量、培養(yǎng)基的厚度及最低抑菌濃度因素的影響，抗生素在小鋼管中的量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈半徑的平方值成直線關(guān)系，從抑菌圈半徑來推算出抗生素的量是抗生素微生物檢定法的理論基礎(chǔ)。應(yīng)用生物檢定平行線設(shè)計(jì)原理，在相同試驗(yàn)條件下將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液進(jìn)行比較，可以抵消培養(yǎng)基的厚度（H）和最低抑菌濃度（C′）的影響；用相同的緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液，可減小標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液在同一培養(yǎng)基中擴(kuò)散系數(shù)（D）的差異；擴(kuò)散時(shí)間（t）和抗生素在小鋼管中的量（M）與滴加供試液密切相關(guān)，是抗生素微生物檢定法操作過程中的最關(guān)鍵步驟之一。

2 藥典對(duì)在小鋼管中滴加抗生素量的控制

抑菌圈半徑的平方值與抗生素在小鋼管中的量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān)系，抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液加入量的準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，《中國藥典》對(duì)在小鋼管中滴加抗生素量的控制方法也作了一定的規(guī)定。

2.1 加樣量的分析

國外藥典和《中國藥典》及其以往版本都采用控制不銹鋼小管的容積來控制加樣量。通過規(guī)定不銹鋼小管高度、內(nèi)徑誤差范圍，來控制不銹鋼小管的容積誤差，從而控制加樣量的準(zhǔn)確性。

現(xiàn)行《中國藥典》2010年版規(guī)定，不銹鋼小管的內(nèi)徑為（6.0±0.1）mm，高為（10.0±0.1）mm，外徑為（7.8±0.1）mm。根據(jù)這一規(guī)定可以對(duì)不銹鋼小管的容積進(jìn)行允許誤差分析，見表1。

表1 不銹鋼小管容積的允許誤差

由表1可以看出，以裝滿小鋼管為度來確定抗生素溶液的加入量，因不銹鋼小管容積的允許誤差偏大，精密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了分析要求。

對(duì)滴加供試液的方法各國藥典都沒有規(guī)定具體的要求，《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ A“抗生素微生物檢定法”規(guī)定：在每1雙碟中對(duì)角的2個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余2個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的高、低兩種濃度的供試品溶液[1]。《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》要求：滴加溶液至鋼管口平滿。傳統(tǒng)的采用目視各小鋼管液面是否一致來決定加樣量，因沒有統(tǒng)一的刻度參照、實(shí)驗(yàn)者視力的差別、各不銹鋼小管位置不同造成的角度上的差別等，對(duì)加樣量都會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。

2.2 加樣時(shí)間的分析

在滴加供試液過程中，因各管分別滴加，順序有先后，加樣時(shí)間不一致，由于溶液在加入不銹鋼小管后即開始向培養(yǎng)基中滲透，先加者先滲透，對(duì)擴(kuò)散時(shí)間（t）會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，所以滴加溶液的間隔時(shí)間不可過長(zhǎng)，以免影響測(cè)定結(jié)果。《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》規(guī)定：滴加溶液的順序?yàn)镾H→TH→TL→SL，以消除加樣操作的系統(tǒng)誤差。連續(xù)滴加雙碟數(shù)目不超過5個(gè)，如果1份溶液滴加雙碟數(shù)目過多，可分組滴加，以縮短滴加溶液的間隔時(shí)間[7]。

3 3種加樣方法比較

3.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

玻璃滴管（自制）；1 mL卡介苗注射器；微量移液器；鋼管放置器；十萬分之一電子天平（Sartorius BP211D）；壓力蒸汽滅菌器（上海，博迅）；ZY-300Ⅳ型多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀（北京，先驅(qū)）；恒溫水浴箱；隔水式培養(yǎng)箱（上海，博迅）；冰箱（青島，海爾）；不銹鋼小管；效價(jià)測(cè)定專用雙碟以及常用玻璃儀器。培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液等。

3.2 統(tǒng)計(jì)分析

本所從2005年4月以來，使用“3.1”所列儀器一直未更換，固定人員做抗生素微生物檢定法實(shí)驗(yàn)，曾在不同階段用自制玻璃滴管、1 mL卡介苗注射器、微量移液器作為抗生素微生物檢定法加樣工具，經(jīng)提取468份檢驗(yàn)記錄統(tǒng)計(jì)分析，以回歸、偏離平行兩項(xiàng)的F值以及可信限率3項(xiàng)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，其結(jié)果存在明顯的相關(guān)性差異。結(jié)果見表2。

表2 3種方法加樣效果比較

從表2可以看出，采用微量移液器定量加樣，對(duì)于擴(kuò)散時(shí)間（t）和抗生素在小鋼管中的量（M）的控制明顯優(yōu)于玻璃滴管液面目測(cè)法和用卡介苗注射器定量加樣法，生物統(tǒng)計(jì)中的回歸和可信限率具有明顯的相關(guān)性。

4 討 論

4.1 抗生素微生物檢定法實(shí)驗(yàn)加樣方法由用不銹鋼小管容積定量改為用微量移液器定量加樣。本文建議定量體積為270 μL，加樣量均低于小鋼管的上沿，使每個(gè)不銹鋼小管內(nèi)溶液的張力一致，又不易濺到不銹鋼小管外，可提高加樣速度，縮短間隔時(shí)間，且移動(dòng)平皿時(shí)不易溢出。

4.2 用微量移液器定量加樣。由于各管所加體積是一定的，可以消除先加先滲透到瓊脂層帶來的體積誤差，實(shí)驗(yàn)過程中不需要考慮在滴加過程中各管已滲透進(jìn)入培養(yǎng)基中的抗生素溶液體積和抗生素溶液在小管中的液面位置，這對(duì)加樣操作帶來了很大的便捷，大大地減少了抗生素在小鋼管中的量（M）的誤差和擴(kuò)散時(shí)間（t）的誤差。

4.3 本方法選用48個(gè)不銹鋼小管進(jìn)行標(biāo)號(hào)，并稱重和測(cè)量?jī)?nèi)外徑，用此法加液在其中滴加同一抗生素溶液進(jìn)行試驗(yàn)，表明所用的不銹鋼小管的內(nèi)外徑大小和重量對(duì)抑菌圈的擴(kuò)散有一定的影響，但很微小。本方法使用的為同一包裝中的不銹鋼小管，可能也會(huì)帶來一定的誤差。

4.4 通過對(duì)不同的加樣方法進(jìn)行比較，本方法的加樣時(shí)間明顯縮短，減少至前兩種方法的一半以下；經(jīng)對(duì)468份檢驗(yàn)報(bào)告可靠性測(cè)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，回歸和可信限率都有較大幅度的提高；偏離平行略有提高，但變化不很明顯。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典 （二部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010，附錄93-8.

[2]丁 勃，楊 娜，謝元超.比濁法測(cè)定抗生素效價(jià)中常見問題及分析[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11（6）：438-40.

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[8]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2000，73.

Method of Dropwise Adding Antibiotics Solution in Microbiological Assay of Antibiotics

TAI Shun-zhang,WANG Xiao-jing
Yanchen Institute for Drug Control,Yancheng 224002

Objective:To explore a sampling method that is used for antibiotics solution dropping in microbiological assay of antibiotics.Methods:Microbiological assays of antibiotics were compared for their differences of experimental principles,source about sampling error and results of experiments to choose the best methods of dropwise adding antibiotics solution.Results and Conclusion:Micropipettor sampling, quantitative 270 μL,was proved to have fast speed,short interval time,precise sample volume,reduced experimental error and better results in reliability bioassay test,which showed to be the better sampling method in the experiment.

Micropipettor;Methods of sample;Microbiological assay of antibiotics;Kinetic equation;Re-liability test

R915

A

1673-7806（2015）03-271-03

邰順章，男，副主任藥師 E-mail:417677528@qq.com

2014-11-15

2015-01-08