細胞毒性篩選在新藥研發中的風險分析

劉亞輝，陳玉文

(沈陽藥科大學工商管理學院，遼寧 沈陽 110016)

細胞毒性篩選在新藥研發中的風險分析

劉亞輝，陳玉文

(沈陽藥科大學工商管理學院，遼寧 沈陽 110016)

目的 分析細胞毒性篩選在新藥研發中存在的風險因素。方法 引入風險管理理念，對細胞毒性篩選相關文獻進行檢索和梳理，提出細胞毒性篩選中存在的風險。結果 細胞模型選擇存在3個風險因素；評價指標確定存在1個風險因素；單指標檢測技術存在7個風險因素，因技術不同風險側重點也不同；多指標檢測技術兩種技術各存在2個風險因素。結論 對新藥研發細胞毒性篩選每一環節的風險進行有效控制，并在此基礎上通過聯合檢測建立體外分層系統毒性篩選平臺，是降低新藥研發因毒性而研發失敗風險的關鍵。

細胞毒性；風險管理；評價指標

新藥研發是一項投資大、風險高、周期長的工程，據統計，上市一種新藥需10～15年，耗資3.5億～5億美元[1]，而毒性已成為新藥研發失敗的主要原因，占 40% ～44%[2]。2005年至2008年，國家藥品審評中心統計的19個不批準品種的原因中，非臨床試驗結果不支持臨床試驗的僅占30%[3]，可見早期毒性篩選在新藥研發中很重要。新藥研發階段細胞毒性篩選的篩選率低、靈敏度不高，如何保證其準確率已成為當前藥物安全性評價工作亟待解決的重大問題。筆者擬從細胞模型的選擇、評價指標的確定及檢測技術的遴選過程3個方面識別細胞毒性篩選的風險因素，為建立可控風險內的體外分層系統的毒性篩選平臺提供依據。

1 細胞模型選擇風險

細胞毒性篩選常用的細胞主要來自人體組織或與人體親緣關系較近的生物體，根據受試物的不同會有不同的選擇。

細胞存在種屬差異性的風險：細胞毒性篩選中來自非人體組織的細胞存在種屬差異性，有可能導致待測化合物的細胞毒性無法真實地表現出來。有學者利用大鼠、小鼠、人和恒河猴的肝細胞評估腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）誘導正常細胞凋亡的敏感性，結果顯示，TRAIL可誘導人正常肝細胞的凋亡，而其他幾個物種動物的肝細胞卻沒有出現凋亡特征，表明肝細胞對TRAIL的敏感性存在種間差異，若將TRAIL用于人類癌癥治療，可能會出現肝毒性[4]。

細胞單一類型無法全面反映機體整體毒作用的風險：單一類型的細胞只能評價對機體某一器官的毒性，而不能反映出對機體的整體毒作用，甚至不能反映待測化合物的毒性機制。雖然胚胎干細胞可以克服采用單一類型終末分化細胞不能全面評價待測化合物對組織器官毒性的缺陷，但目前存在分化細胞高可變性、異常基因組型、分化操作方法標準化等問題[5-6]。

細胞不健康、難以培養等自身風險：待測化合物的細胞毒性是通過與細胞作用觀察細胞狀態來反映的。細胞毒性篩選需要大量的細胞株，并且還要進行平行、多批次處理，因此細胞自身的健康情況、穩定狀況以及培養的難易程度都可能會影響實驗結果。

2 評價指標確定風險

評價指標是基于細胞數量、形態、生理特征和結構評價細胞毒性變化特征的指標[4]。目前此類指標不超過20個，且大部分與生長增殖、代謝功能及膜的完整性有關[7]。選擇的評價指標能否客觀、靈敏地反映待測化合物的細胞毒性，直接決定著篩選的成敗。以選擇細胞膜的完整性作為評價指標為例，有些待測化合物并不會引起細胞膜破損，但實際上確實引起了細胞壞死。

3 檢測技術風險

3.1 單指標

根據不同的評價指標，可以建立不同的檢測技術。按照評價指標可將檢測技術分為細胞生長抑制／增殖、膜完整性和細胞代謝活性3類。以細胞生長抑制／增殖為評價指標的技術是四氮唑鹽（MTT）比色法、黃酰羅丹明B法和集落形成試驗；以膜的完整性為評價指標的技術有乳酸脫氫酶釋放法、臺盼藍染色法、熒光染色法和中性紅攝取法；以細胞代謝活性為評價指標的技術阿爾瑪藍顯色法、三磷酸腺苷(ATP)生物熒光技術和同位素摻入法。通過對近10年文獻進行整理和總結，單指標檢測技術存在的風險因素有7個，每種技術存在的風險同中有異，詳見表1。

細胞接種量過多或太少的風險：細胞接種量是影響實驗結果的重要因素。細胞過少，生成的反應物會偏低；導致靈敏度降低。細胞過多，飽和后細胞繼續增殖會導致氧和營養被大量消耗，乳酸、氨等有毒代謝產物大量積累，導致細胞凋亡，干擾待測化合物篩選結果的準確性[8]。

培養基的成分／種類干擾的風險：培養基的血清濃度和酚紅等有影響試驗孔吸光度值的可能，胎牛血清可使乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量增加，使MTT比色法出現難溶的蛋白沉淀。

表1 檢索文獻中反映細胞毒性篩選單指標的檢測技術風險因素統計

反應條件選擇不恰當的風險：反應條件如時間、溫度、pH、測定波長等參數的確定及各類試劑的選擇，是保證實驗順利進行的關鍵。細胞吸光度值與檢測波長間具有較大的相關性，使用不同的檢測波長細胞的吸光度值也會發生很大的變化。用來提取活細胞攝入的中性紅染料是否能夠提取完全，對結果同樣有很大的影響。

操作過程丟失細胞的風險：檢測技術中涉及到的清洗細胞或上清步驟，操作繁雜，操作不當很容易導致細胞或反應產物丟失，從而影響結果的測定[9]。

待測化合物與染料反應的風險：MTT比色法中，有研究發現，過氧化物會抑制將近95%的MTT與O2-反應。還有研究證實，多酚類化合物可直接與MTT反應，即使沒有細胞存在，MTT吸光值也隨之增高。

染料對細胞具有毒性的風險：檢測技術中染料的性質很重要。染料一旦對細胞具有毒性，這種毒性就會被誤認為是待測化合物對細胞的毒性，導致待測化合物毒性被高估。

結果判斷客觀性差的風險：集落形成試驗是通過顯微鏡計數來確定集落數量，計算煩瑣，主觀性強[10]。臺盼藍染色法細胞計數為純手工操作，易受主觀因素的影響。

3.2 多指標

3.2.1 流式細胞儀

流式細胞儀檢測快速、靈敏，對操作人員的專業要求高，影響其準確度的風險有2個。

制備單細胞懸液損傷細胞的風險：在制備單細胞懸液的過程中，懸液細胞很容易聚集成團，在采取方法分散細胞時很容易瞬間或持久地影響細胞的性質，如顯而易見的細胞膜破損、難以察覺的線粒體活性變化等。這種對細胞原有特性的破壞，直接影響了細胞毒性篩選的準確度。

操作不當丟失細胞的風險：使用流式細胞儀分析細胞內成分時，需要進行熒光染色、細胞固定和反復沖洗的步驟。沖洗過程操作不當很容易丟失細胞，影響細胞毒性篩選的準確度。

3.2.2 高內涵成像分析技術

高內涵成像分析技術目前尚處于發展階段，還有大量需要解決的技術難題，其中篩選試劑和匹配軟件開發是最突出的問題。

熒光染料相互干擾的風險：高內涵成像分析技術中采用的多種熒光染料共同沾染細胞，但染料會相互干擾導致其靈敏度下降[11]。而目前熒光染料的整合應用并未得到長足發展。

匹配軟件開發不足的風險：高內涵成像分析技術是以影像為基礎的篩選技術，在篩選過程中會產生大量數據，但目前高內涵成像分析技術還無法處理大量數據，也不具備比例成像分析和對細胞內所有熒光物質的分析能力，軟件開發不足直接影響了高內涵成像分析技術的靈敏度和效率。

4 結語

細胞模型選擇、評價指標確定和檢測技術遴選是細胞毒性篩選重要的環節，對每一環節的風險進行有效的風險管理，并在此基礎上通過聯合檢測建立體外分層系統毒性篩選平臺，是降低新藥因毒性而研發失敗或退市的風險的關鍵。

[1]吳 慧，彭 英，孫建國，等.體外代謝在新藥早期評價中的應用與發展[J].藥學學報，2013，48（7）：1 071-1 079.

[2]呂秋軍.新藥研發過程中毒理學研究方法的進展——毒性的原因和早期毒性篩選[J].中國新藥雜志，2006，15（5）：328-334.

[3]馬 .早期毒性優化篩選在藥物候選決策中的作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（1）：419.

[4]劉 濤，郭 辰.毒理學研究中的體外細胞毒性評價[J].生命科學，2014，26（3）：319-324.

[5]賈源君，裴軼勁.干細胞在發育毒性體外模型建立中的應用研究進展[J].中國醫藥導報，2015，12（2）：152-155.

[6]邊育紅，莊朋偉，王 麗，等.藥物潛在毒性發現技術及其在中藥安全性評價中的應用展望[J].中草藥，2011，42（12）：2 379-2 385.

[7]曲艷燕，呂秋軍.高通量細胞毒性篩選的研究進展[J].國外醫學：藥學分冊，2002，29（4）：237-241.

[8]管 瑩，夭建華，高 茜，等.CHO細胞初始接種密度對細胞毒性試驗結果的影響[J].化學與生物工程，2012，29（29）：43-46.

[9]羅奇志，林 琳，王芙艷，等.MTT方法的優化[J].激光生物學報，2014，23（3）：279-282.

[10]牛紅軍，李邦東，孫 昊，等.抗腫瘤藥物體外篩選技術研究進展[J].生命科學儀器，2014，12（2）：29-33.

[11]胡晶陽，嚴春琳，朱 彥，等.高內涵篩選應用于中藥現代化的前景展望[J].天津中醫藥大學學報，2013，32（2）：120-124.

The Risk Research of Cytotoxicity Screening in Research and Development of New Drugs

Liu Yahui，Chen Yuwen
(School of Business Administration，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang，Liaoning,China 110016)

Objective To analyse the risk factors in the research and development of new drugs of cytotoxic screening.Methods The risk management in cytotoxicity screening was introduced，the literature was searched and sorted to bring out the risk in cytotoxicity screening.Results Cell models had three risk factors;the evaluation index had one risk factors;the single index detection techniques had seven risk factors.Conlusion It is the key to reduce the R＆D failures due to toxicity through effective controlling of the risk in every aspect of cytotoxic screening in R＆D；on this basis，establish the tiered system in vitro toxicity screening platform by joint detection.

cytotoxicity；risk management；evaluation index

R965.1

A

1006-4931(2015)17-0001-02

劉亞輝，男，碩士研究生，研究方向為新藥研發風險控制，（電子信箱）847087905＠qq.com；陳玉文，男，教授，博士研究生導師，研究方向為新藥研發風險，本文通訊作者，（電子信箱）cywwyc＠163.com。

2015-03-30)

科技部“十二五”重大新藥創制國家科技重大專項“遼寧省國家重大新藥創制綜合平臺——基于信息管理的新藥研發風險控制技術”，項目編號：2013ZX09301305。